使用"彩虹"和"延时共聚焦成像"可视化活斑马鱼中发育中的脑

在发育的早期阶段，专门的祖细胞池在增殖区反复分裂，产生不同的子细胞阵列。然后，在这个发育期出生的细胞将分化和旅行，形成新生的器官。在神经系统中，前视像状胶质在心室区产生不成熟的神经元。当神经元从心室迁移并成熟时，膨胀的组织最终形成大脑高度复杂的结构^1,21，2，3，4，5，6。^,3,4,5,6前祖的分裂与神经元的分化和迁移之间的协调将决定大脑的最终大小、形状和功能，直接影响行为^{77、8、9、10。8,9,10}虽然严格控制这些过程显然对于正常的大脑发育至关重要，但监管这些动力学的全球机制并不十分了解。在这里，我们描述了一个工具，以细胞分辨率研究神经系统的发展，允许研究人员可视化在发育中的斑马鱼大脑中与B彩虹的祖细胞和神经元，并通过延时共聚焦显微镜¹¹跟踪他们的行为随着时间的推移。该方法也可以适应可视化发育中的胚胎的其他部分。

为了观察和区分正在发育中的斑马鱼大脑中的细胞，我们采用了”彩虹细胞标记技术^11″。Brainbow利用随机确定的三种不同荧光蛋白（FPs）的组合表达来标记细胞群。虽然Brainbow表达式的默认表达式是红色FP dTomato，但由酶Cre重组酶的重组导致mCerulean（青色荧光蛋白，CFP）或黄色荧光蛋白（YFP）12，13^12,13的表达。单元格中表达的每个 FP 的总量使其具有独特的色调，从而允许从相邻单元格中明确的视觉区别。此外，当一个祖细胞分裂时，每个子细胞将继承其母细胞的颜色，产生颜色编码的克隆，并允许研究人员追踪细胞系^{11，14。11,}虽然最初用于分析小鼠¹²的神经元回路，但此后，Brainbow已在各种模型生物中表达，包括斑马鱼^15。

我们的技术基于以前的多色标签和成像方法，在活斑马鱼中直接成像多个颜色编码的克隆。由于斑马鱼作为胚胎的光学透明度，非常适合成像实验^16，而以前的研究已经利用斑马鱼中的B彩虹来研究各种组织，包括神经系统11、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25。^{11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26，,27}.直接成像生物体的能力，以及它们的快速外生发育，使斑马鱼成为脊椎动物发展的宝贵模型。与哺乳动物的大脑相比，斑马鱼后脑的整个增殖区随时可供成像，而不会破坏其内源环境^6。这允许在活的有机体中进行实验，而不是在体外或固定组织制剂中进行。与固定成像实验相比，体内研究允许纵向设计，生成数小时的数据，可以分析模式，从而增加观察相对罕见事件的可能性。根据感兴趣的事件的速度和长度，研究人员可以选择进行短（1⁄2 小时）或长（高达 ±16 h）的延时成像实验。通过使用斑马鱼热冲击促进剂70（hsp70，hsp），B彩虹表达可以暂时控制^{28，29。28,}此外，由这个启动器诱导的马赛克表达式非常适合标记和跟踪许多克隆^11。

直观地识别活脑中的多个克隆的能力是这种方法的一个优点。以前研究克隆在神经系统发育中的作用的重要研究利用逆转录病毒载体使用单个FP或其他易于可视化的蛋白质标记单个祖细胞及其后代。这种标签允许研究人员观察一个克隆随着时间的推移，无论是体外或体内²2，30，31，32，33，34，35，36，37，38。^{,30,31,32,33,34,35,36,37,38}与跟踪一个克隆细胞行为的方法不同，Brainbow的不同颜色允许研究人员观察克隆之间的动态。此外，通过使用Brainbow标记大脑中的许多克隆，根据标记单个克隆¹¹的技术，收集了有关克隆行为的其他数据。重要的是，这里描述的方法可以扩大，以产生发育比较之间的鱼经历了不同的遗传或药理操纵^18。总体而言，这些优势使表达蓝彩虹的斑马鱼的体内共聚焦成像的延时技术成为探索脊椎动物神经系统发展的理想研究人员，特别是那些对克隆人作用感兴趣的人。