Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

In de vroege ontwikkelingsfasen delen poelen van gespecialiseerde voorlopercellen zich herhaaldelijk in proliferative zones, waardoor verschillende arrays van dochtercellen worden geproduceerd. De cellen geboren tijdens deze ontwikkelingsperiode zal dan differentiëren en reizen naar de ontluikende organen te vormen. In het zenuwstelsel, voorouders zoals radiale glia aanleiding geven tot onrijpe neuronen in ventriculaire zones. Als neuronen migreren uit de buurt van ventrikels en volwassen, het uitdijende weefsel vormt uiteindelijk de zeer complexe structuren van de hersenen^1,2,3,4,5,6. De coördinatie tussen de verdeling van de voorouders en differentiatie en migratie van neuronen zal de uiteindelijke grootte, vorm en dus functie van de hersenen bepalen, die direct gedrag^{beïnvloeden 7,8,9,10}. Hoewel strakke controle over deze processen duidelijk cruciaal is voor de normale ontwikkeling van de hersenen, zijn de globale mechanismen die deze dynamiek reguleren niet goed begrepen. Hier beschrijven we een hulpmiddel om de ontwikkeling van het zenuwstelsel te bestuderen met een cellulaire resolutie, waardoor onderzoekers voorlopercellen en neuronen in vivo in het zich ontwikkelende zebravisbrein met Brainbow kunnen visualiseren en hun gedrag in de loop van de tijd kunnen volgen via time-lapse confocale microscopie¹¹. De aanpak kan ook worden aangepast om andere delen van het zich ontwikkelende embryo te visualiseren.

Om cellen in het zich ontwikkelende zebravisbrein te observeren en te onderscheiden, hebben we de Brainbow cellabelingtechniek¹¹aangepast. Brainbow maakt gebruik van de willekeurig bepaalde, combinatorische expressie van drie verschillende fluorescerende eiwitten (FPs) om een populatie van cellen te labelen. Terwijl de standaardexpressie voor Brainbow-expressie de rode FP dTomato is, resulteert recombinatie door het enzym Cre recombinase in expressie van mCerulean (cyaan fluorescerend eiwit, GVB) of geel fluorescerend eiwit (YFP)^12,13. De gecombineerde hoeveelheid van elke FP uitgedrukt in een cel geeft het een unieke tint, waardoor duidelijk visueel onderscheid van naburige cellen. Bovendien, wanneer een voorloper cel verdeelt, zal elke dochtercel erven de kleur van zijn moedercel, producerenkleurgecodeerde klonen en waardoor onderzoekers celafstamming^11,,14traceren . Terwijl oorspronkelijk gebruikt om neuronale circuits bij muizen¹²te analyseren, is Brainbow sindsdien uitgedrukt in een breed scala van modelorganismen, waaronder zebravis¹⁵.

Onze techniek bouwt voort op eerdere multicolor labeling en imaging methoden om direct beeld meerdere kleurgecodeerde klonen na verloop van tijd in levende zebravissen. Vanwege hun optische transparantie als embryo’s, zebravissen zijn zeer geschikt voor beeldvorming experimenten¹⁶, en eerdere studies hebben brainbow gebruikt in zebravissen om een verscheidenheid van weefsels te bestuderen, met inbegrip van het zenuwstelsel^{11,15,17,19,19,20,21,22,23,24,25, 26,27}. De mogelijkheid om direct beeld in het levende organisme, samen met hun snelle ex-utero ontwikkeling, maken zebravissen een waardevol model van gewervelde ontwikkeling. In tegenstelling tot de zoogdierhersenen is de gehele proliferative zone van de zebravisachterbrein direct beschikbaar voor beeldvorming zonder verstoring van zijn endogene omgeving⁶. Hierdoor kunnen experimenten worden uitgevoerd in het levende organisme, in plaats van in vitro of vaste weefselpreparaten. In tegenstelling tot vaste beeldvormingsexperimenten maken in vivo studies een longitudinale ontwerp mogelijk, waardoor uren aan gegevens worden geproduceerd die kunnen worden geanalyseerd op patronen, waardoor de kans op het waarnemen van relatief zeldzame gebeurtenissen toeneemt. Afhankelijk van de snelheid en lengte van de gebeurtenissen van belang, onderzoekers kunnen ervoor kiezen om korte (1-2 uur) of lange (tot ~ 16 uur) time-lapse imaging experimenten uit te voeren. Door het gebruik van de zebrafish heat shock promotor 70 (hsp70, hsp), Brainbow expressie kan tijdelijk worden gecontroleerd^28,29. Bovendien, de mozaïek uitdrukking geïnduceerd door deze promotor is zeer geschikt voor etikettering en het bijhouden van vele klonen¹¹.

De mogelijkheid om visueel te identificeren meerdere klonen in de levende hersenen is een voordeel van deze methode. Belangrijke eerdere studies die de rol van klonen binnen de ontwikkeling van het zenuwstelsel onderzocht gebruikt retrovirale vectoren om een enkele voorloper cel en zijn nakomelingen label met behulp van een enkele FP of andere gemakkelijk gevisualiseerde eiwitten. Een dergelijke etikettering stelt onderzoekers in staat om in de loop van de tijd één kloon te observeren, hetzij in vitro , hetzij in vivo^{2,30,31,32,33,34,35,36,37,38}. In tegenstelling tot methoden om het gedrag van cellen in één kloon te volgen, stellen de verschillende kleuren van Brainbow onderzoekers in staat om dynamiek onder klonen te observeren. Bovendien, door brainbow te gebruiken om vele klonen binnen de hersenen te etiketteren, worden de extra gegevens over clonal gedrag verzameld met betrekking tot technieken die één enkele kloon^etiket1. Belangrijk is dat de hier beschreven benaderingen kunnen worden uitgebreid om ontwikkelingsvergelijkingen te genereren tussen vissen die verschillende genetische of farmacologische manipulaties hebben ondergaan¹⁸. Over het algemeen maken deze voordelen time-lapse in vivo confocale beeldvorming van Brainbow-uitdrukkende zebravissen ideaal voor onderzoekers die de ontwikkeling van het gewervelde zenuwstelsel onderzoeken, met name diegenen die geïnteresseerd zijn in de rol van klonen.