Summary

Mesure de la phagocytose d'Aspergillus fumigatus Conidia par des leucocytes humains à l'aide de la cytométrie du flux

Published: December 07, 2019
doi:

Summary

Ce protocole fournit une méthode rapide et fiable pour mesurer quantitativement la phagocytose d’Aspergillus fumigatus conidia par les phagocytes primaires humains utilisant la cytométrie de flux et pour discriminer la phagocytose des conidies de la simple adhérence aux leucocytes.

Abstract

L’infection pulmonaire invasive par le moule Aspergillus fumigatus pose une grande menace pour les patients immunocompromis. Les concarnes fongiques inhalées (spores) sont éliminées des alvéoles pulmonaires humaines en étant phagocytosed par des monocytes innés et/ou des neutrophiles. Ce protocole offre une mesure rapide et fiable de la phagocytose par cytométrie de flux utilisant des conidies étiquetées par isothiocyanate de fluorescéine (FITC) pour la co-incubation avec les leucocytes humains et la contre-cellule subséquente avec un anticorps anti-FITC pour permettre la discrimination des conidies intériorisées et cellulaires. Les principaux avantages de ce protocole sont sa rapidité, la possibilité de combiner l’analyse avec l’analyse cytométrique d’autres marqueurs cellulaires d’intérêt, l’analyse simultanée des monocytes et des neutrophiles à partir d’un seul échantillon et son applicabilité à d’autres champignons ou bactéries muraux cellulaires. La détermination des pourcentages de phagocytosing leucocytes fournit un moyen aux microbiologistes pour évaluer la virulence d’un agent pathogène ou pour comparer les espèces pathogènes wildtypes et mutants ainsi qu’aux immunologistes pour étudier les capacités humaines de leucocyte pour combattre des agents pathogènes.

Introduction

L’aspergillose pulmonaire invasive est une grande menace pour les patients immunocompromis car les options de traitement sont limitées et seulement réussies sur le diagnostic tôt, qui mène aux taux élevés de mortalité1. Les agents infectieux sont des conidies (spores) de la moisissure Aspergillus fumigatus qui sont omniprésentes dans la plupart des habitats2. Les conidies sont inhalées, passent à travers les voies respiratoires et peuvent enfin entrer dans les alvéoles pulmonaires. Chez les humains immunocompétents, ces conidies sont éliminées par des cellules immunitaires innées telles que les monocytes ou les macrophages et les granulocytes neutrophiles, qui prennent (phagocytose) et digèrent les pathogènes3. La phagocytose est également importante pour les microbiologistes et les immunologistes lorsqu’elles s’intéressent aux interactions hôte-pathogène. Les essais de confrontation, tels que la co-incubation des leucocytes et des conidies, incluent souvent l’étiquetage des spores par fluorescein ou son isothiocyanate dérivé de fluorescein (FITC). À l’aide d’un microscope, il est simple d’identifier les conidies fluorescentes intériorisées et de déterminer les conidies attachées/adhérentes, bien que cette approche soit lourde et réalistement limitée à quelques centaines de cellules4. Cependant, dans la cytométrie de flux qui permet facilement l’analyse de centaines de milliers de cellules en quelques minutes, la coloration différentielle des conidies phagocytosed et adhérentes est essentielle. Par conséquent, de nombreux protocoles s’appuient sur Trypan Blue pour éteindre FITC-fluorescence de conidia adhérents5,6,7,8. Une autre approche consiste à exploiter le transfert d’énergie par résonance de fluorescence du bromure d’éhidium et du FITC pour émettre du rouge au lieu de la fluorescence verte des conidies adhérentes9,10,11. Si des anticorps spécifiques sont disponibles, comme c’est le cas pour certaines bactéries, les particules cellulaires peuvent être directement tachées12,13.

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer rapidement et quantitativement la phagocytose des conidies A. fumigatus labeled DE FITC par les leucocytes humains avec l’attachement des spores aux cellules et le manque d’interaction en employant un anticorps anti-FITC allophycocyanin (APC) couplé. La méthode permet également l’analyse cytométrique simultanée d’autres marqueurs cellulaires qui peuvent être utilisés pour l’analyse séparée de la phagocytose par les monocytes et les neutrophiles du même échantillon.

Le protocole peut être appliqué pour la caractérisation des souches fongiques (par exemple, plusieurs espèces d’Aspergillus et d’autres moisissures du genre Mucorales présentés ici) et leurs mutants14 et la recherche immunologique sur les phagocytes, tels que les leucocytes des individus immunocompromis.

Protocol

Ce protocole comprend l’utilisation de manteaux bouffi humains obtenus auprès de l’Institut de médecine transfusionnelle, l’hôpital universitaire d’Iéna et de sang veineux frais prélevé sur des patients, tous deux après le consentement éclairé écrit des donneurs conformément à l’approbation du comité d’éthique 4357-03/15. 1. Préparation d’Aspergillus fumigatus Conidia Cultivez A. fumigatus sur 1,5% malt agar Petri plats pendant 5 jours à 37 oC sans C…

Representative Results

En mesurant la phagocytose de A. fumigatus conidia par les cellules phagocytiques humaines, la discrimination entre l’intériorisation véritable et le simple attachement des conidies aux cellules est un obstacle, surtout quand il s’agit de méthodes à haut débit telles que la cytométrie du débit. Afin de surmonter cet obstacle, nous présentons un protocole rapide et fiable basé sur la coloration des conidies avec le colorant fluorescent FITC avant la co-incubation des cellules et des conidies, suivi d’une…

Discussion

Ce protocole présente une méthode cytométrique à débit rapide pour mesurer l’interaction de A. fumigatus conidia avec un grand nombre de leucocytes humains primaires qui n’est pas possible dans les protocoles microscopiques communs. L’imagerie des cellules avec un microscope et le comptage manuel des conidies intériorisées est lourd et peut être fait de façon réaliste pour quelques centaines de cellules seulement. La cytométrie de flux surmonte ce problème en mesurant des milliers de cellules en quel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Mme Pia Stier pour son excellente assistance technique. M. von Lilienfeld-Toal est soutenu par le Center for Sepsis Control and Care (Ministère fédéral allemand de l’éducation et de la santé, BMBF, FKZ 01E01002) et InfectoGnostics Research Campus (BMBF, FKZ 13GW0096D). Thi Ngoc Mai Hoang est soutenu par l’École de communication microbienne de Jena (Deutsche Forschungsgemeinschaft, FKZ 214/2)

Materials

Adhesive foil Brand 701367
anti-CD14 V500 BD Biosciences 561391 clone M5E2
anti-CD45 BUV395 BD Biosciences 563792 clone HI30
anti-CD66b PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 562254 clone G10F5
anti-FITC APC ThermoFisher Scientific 17-7691-82 clone NAWESLEE
Cell culture plate, 12-well Greiner Bio-one 665180
Cell scraper Bioswisstech 800020
Cell strainer, 30 µm Miltenyi Biotech 130-098-458 SmartStrainer
Cytometer BD Biosciences LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (blue), 405 nm (violet), 355 nm (UV) and 640 nm (red)
Detergent Sigma Aldrich P1379 Tween 20, 0.01% in PBS
Drigalski spatula Carl Roth PC59.1
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED3SS-500g 2 mM in PBS
Erythrocyte lysis buffer 0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA
Fetal Calf Serum (FCS) Biochrom AG S 0115 10% in RPMI 1640
Fluorescein isothiocyanate (FITC) Sigma Aldrich F3651-100MG 0.1 mM in Na2CO3 /PBS solution
Formaldehyd Carl Roth PO87.3 Histofix
Malt agar (1.5%) malt extract (40 g), yeast extract (4 g), agar (15 g), Aqua dest. (1 L), adjust pH to 5.7-6.0, sterilise at 121 °C for 35 minutes
Na2CO3 Carl Roth 8563.1 0.1 M in PBS
Petri dish Greiner Bio-one 633180
Phosphat Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific 189012-014 without Calcium, without Magnesium
RPMI 1640 ThermoFisher Scientific 61870010 RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement
Rotator Miltenyi Biotech 130-090-753 MACSmix Tube Rotator
Round-bottom tube, 7.5 mL Corning REF 352008
Software for data acquisition and analysis BD Biosciences FACSDiva 8.0
V-bottom plate, 96 well Brand 781601 untreated surface

References

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Cite This Article
Hartung, S., Rauh, C., Böttcher, S., Hoang, M. T. N., Jahreis, S., Rummler, S., Hochhaus, A., von Lilienfeld-Toal, M. Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (154), e60397, doi:10.3791/60397 (2019).

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