Summary

Induzieren posttraumatische Epilepsie in einem Mausmodell von sich wiederholenden diffusen traumatischen Hirnverletzungen

Published: February 10, 2020
doi:

Summary

Dieses systematische Protokoll beschreibt ein neues Tiermodell der posttraumatischen Epilepsie nach wiederholten leichten Schädel-Hirn-Verletzungen. Der erste Teil beschreibt die Schritte zur traumatischen Hirnverletzungsinduktion mit einem modifizierten Gewichtsabnahmemodell. Der zweite Teil enthält Anweisungen zum chirurgischen Ansatz für ein- und mehrkanalige elektroenzephalographische Datenerfassungssysteme.

Abstract

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind eine der Hauptursachen für erworbene Epilepsie. TBI kann zu einer fokalen oder diffusen Hirnverletzung führen. Fokale Verletzungen sind das Ergebnis direkter mechanischer Kräfte, die manchmal durch den Schädel eindringen und eine direkte Läsion im Hirngewebe verursachen. Diese sind während der Bildgebung des Gehirns als Bereiche mit Kontusion, Zerrung und Blutungen sichtbar. Fokale Läsionen induzieren neuronale Todesfälle und gliale Narbenbildung und sind bei 20% bis 25% aller Menschen, die ein TBI ereignen, vorhanden. In den meisten TBI-Fällen wird die Verletzung jedoch durch Beschleunigungsverzögerungskräfte und anschließende Gewebescherungen verursacht, was zu nicht fokalen, diffusen Schäden führt. Eine Subpopulation von TBI-Patienten entwickelt nach einer Latenzzeit von Monaten oder Jahren weiterhin eine posttraumatische Epilepsie (PTE). Derzeit ist es unmöglich vorherzusagen, welche Patienten PTE entwickeln werden, und Anfälle bei PTE-Patienten sind eine Herausforderung zu kontrollieren, was weitere Forschung erfordert. Bis vor kurzem beschränkte sich das Feld auf nur zwei Tier-/Nagetiermodelle mit validierten spontanen posttraumatischen Anfällen, die beide mit großen fokalen Läsionen mit massivem Gewebeverlust im Kortex und manchmal subkortikalen Strukturen aufwiesen. Im Gegensatz zu diesen Ansätzen wurde festgestellt, dass diffuses TBI, das mit einem modifizierten Gewichtsabfallmodell induziert wird, ausreicht, um die Entwicklung spontaner krampfhatiger und nicht krampfhaniger Anfälle zu initiieren, selbst wenn es keine fokalen Läsionen oder Gewebeverlust gibt. Ähnlich wie bei menschlichen Patienten mit erworbener posttraumatischer Epilepsie bietet dieses Modell eine Latenzzeit nach einer Verletzung vor dem Anfall. In diesem Protokoll wird der Gemeinschaft ein neues Modell der posttraumatischen Epilepsie zur Verfügung gestellt, in dem detailliert beschrieben wird, wie diffuses nicht-lesionales TBI induziert werden kann, gefolgt von einer kontinuierlichen Video-Elektroenzephalografischen Tierüberwachung über mehrere Monate hinweg. Dieses Protokoll wird die Handhabung von Tieren, das Gewichtfallverfahren, die Elektrodenplatzierung für zwei Erfassungssysteme und die häufigen Herausforderungen in jedem der Schritte der Operation, der postoperativen Überwachung und der Datenerfassung beschreiben.

Introduction

Jedes Jahr sind weltweit schätzungsweise 60 Millionen Menschen von TBI betroffen. Betroffene Personen haben ein höheres Risiko, epilepsie zu entwickeln, die sich Jahre nach der anfänglichen Verletzung manifestieren kann. Obwohl schwere TBIs mit einem höheren Risiko für Epilepsie verbunden sind, erhöht selbstmildes TBI die Wahrscheinlichkeit, epilepsie nanzuentwickeln 1,2,3,4. Alle TBIs können als fokal, diffus oder als Kombination aus beidem klassifiziert werden. Diffuse Hirnverletzungen, die in vielen, wenn nicht allen TBIs vorhanden sind, sind das Ergebnis von Hirngeweben unterschiedlicher Dichte, die durch Beschleunigungsverzögerung und Rotationskräfte gegeneinander scheren. Per Definition tritt diffuse Verletzung nur isoliert bei leichten/konkussiven nicht durchdringenden Hirnverletzungen auf, bei denen keine Hirnläsionen auf Computertomographie-Scans sichtbar sind5.

Derzeit gibt es zwei kritische Probleme beim Management von Patienten, die an posttraumatischen Epilepsien (PTE) leiden oder einem Risiko ausgesetzt sind. Die erste ist, dass, sobald PTE manifestiert hat, Anfälle resistent gegen verfügbare Antiepileptika (AEDs)6sind. Zweitens sind AEDs ebenso wirkungslos bei der Verhinderung der Epileptogenese, und es gibt keine wirksamen alternativen therapeutischen Ansätze. Um dieses Defizit anzugehen und bessere therapeutische Ziele und Behandlungskandidaten zu finden, wird es notwendig sein, neue zelluläre und molekulare Mechanismen an der Wurzel von PTE6zu erforschen.

Eines der herausragenden Merkmale der posttraumatischen Epilepsie ist die latente Periode zwischen dem anfänglichen traumatischen Ereignis und dem Beginn spontaner, unprovozierter, wiederkehrender Anfälle. Die Ereignisse, die in diesem zeitlichen Fenster auftreten, sind ein natürlicher Fokus für Forscher, da dieses Zeitfenster die Behandlung und Prävention von PTE insgesamt ermöglichen könnte. Tiermodelle werden am häufigsten für diese Forschung verwendet, weil sie mehrere verschiedene Vorteile bieten, nicht zuletzt, dass eine kontinuierliche Überwachung menschlicher Patienten sowohl unpraktisch als auch kostspielig über solche potenziell langen Zeiträume wäre. Darüber hinaus können zelluläre und molekulare Mechanismen an der Wurzel der Epileptogenese nur in Tiermodellen erforscht werden.

Tiermodelle mit spontanen posttraumatischen Anfällen und Epilepsie werden gegenüber Modellen bevorzugt, bei denen Krampfanfälle nach TBI durch weniger physiologisch relevante Mittel induziert werden, z. B. durch Chemokonvulsiva oder elektrische Stimulation akut, chronisch oder durch Entmundung. Spontane posttraumatische Anfallsmodelle testen, wie TBI das gesunde Gehirnnetzwerk verändert, was zu epilektiöser Genese führt. Studien mit zusätzlicher Stimulation nach TBI bewerten, wie die Exposition gegenüber TBI die Anfallsschwelle verringert und die Anfälligkeit für Anfälle beeinflusst. Die Vorteile von Tiermodellen mit chemisch induzierten Anfällen oder mit elektrischer Stimulation liegen darin, die spezifischen Mechanismen der Refraktorik auf AEDs und die Wirksamkeit bestehender und neuartiger AEDs zu testen. Der Grad der Relevanz und Übersetzung dieser Daten für den Menschen kann jedochaufgrund der folgenden Aspekte mehrdeutig sein 7: 1) Die Anfallsmechanismen können sich von denen unterscheiden, die nur durch TBI induziert werden; 2) nicht alle diese Modelle führen zu spontanen Anfällen7; 3) Läsionen, die durch das Krampmittel selbst, mit der für seine Entbindung erforderlichen Kanüle oder durch stimulierte Elektrodenplatzierung in Tiefenstrukturen (z.B. Hippocampus oder Amygdala) erzeugt werden, können bereits eine erhöhte Anfallsanfälligkeit und sogar hippocampale epiptiforme Feldpotentialeverursachen 7. Darüber hinaus produzieren einige Krampfmittel (d.h. Kainsäure) direkte Hippocampusläsionen und Sklerose, die nach diffusem TBI nicht typisch ist.

Bis vor kurzem gab es nur zwei Tiermodelle der posttraumatischen Epilepsie: kontrollierte kortikale Einschlage (CCI, fokal) oder Flüssigkeitspercussion-Verletzung (FPI, fokal und diffus)8. Beide Modelle führen zu großen fokalen Läsionen neben Gewebeverlust, Blutungen und Gliose bei Nagetieren8. Diese Modelle imitieren posttraumatische Epilepsie, die durch große fokale Läsionen induziert wird. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass wiederholtes (3x) diffuses TBI für die Entwicklung von spontanen Anfällen und Epilepsie bei Mäusen auch ohne fokale Läsionen9ausreicht, wobei ein drittes Nagetier-PTE-Modell mit bestätigten spontanen wiederkehrenden Anfällen hinzugefügt wird. Dieses neue Modell imitiert zelluläre und molekulare Veränderungen, die durch diffuses TBI induziert werden, und repräsentiert die menschliche Bevölkerung besser mit milden, konkussiven TBIs. In diesem Modell ermöglicht die latente Periode von drei Wochen oder mehr vor dem Anfall des Anfalls und das Auftreten von späten, spontanen, wiederkehrenden Anfällen die Untersuchung der Ursachen der posttraumatischen Epileptogenese, die Erprobung der Wirksamkeit präventiver Ansätze und neuer therapeutischer Kandidaten nach dem Anfall und hat Potenzial für die Entwicklung von Biomarkern der posttraumatischen Epileptogenese, da etwa die Hälfte der Tiere eine posttraumatische Epilepsie entwickeln.

Die Wahl des Tiermodells für die Untersuchung der posttraumatischen Epilepsie hängt von der wissenschaftlichen Frage, der Art der untersuchten Hirnverletzung und der Frage ab, mit welchen Werkzeugen die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen bestimmt werden. Letztlich muss jedes Modell der posttraumatischen Epilepsie sowohl das Auftreten spontaner Anfälle nach TBI als auch eine anfängliche Latenzzeit bei einer Teilmenge von TBI-Tieren nachweisen, da nicht alle Patienten, die ein TBI erkranken, Epilepsie entwickeln. Dazu wird in diesem Protokoll die Elektroenzephalographie (EEG) bei gleichzeitiger Videoerfassung verwendet. Das Verständnis der technischen Aspekte hinter Hardware und Ansätzen zur Datenerfassung ist für eine genaue Dateninterpretation von entscheidender Bedeutung. Zu den entscheidenden Hardwareaspekten gehören die Art des Aufzeichnungssystems, die Art der Elektroden (Schraube oder Drahtleitung) und das Material, aus dem sie bestehen, die synchronisierte Videoerfassung (als Teil des EEG-Systems oder Eines Drittanbieters) und die Eigenschaften des Computersystems. Je nach Studienziel, EEG-Ereignissen von Interesse, weiterer Analysemethode und Nachhaltigkeit der Datenspeicherung müssen in jedem System typisiert die entsprechenden Erfassungsparameter festgelegt werden. Schließlich ist die Methode der Elektrodenkonfiguration (Montage) zu berücksichtigen, da jede vor- und nachteile hat und die Dateninterpretation beeinflusst.

Dieses Protokoll beschreibt, wie man das modifizierte Marmarou-Gewichtsabfallmodell10,11 verwendet, um diffuse Verletzungen zu induzieren, die zu spontanen, unprovozierten, wiederkehrenden Anfällen bei Mäusen führen, beschreibt chirurgische Ansätze zur Erfassung eines ein- und mehrkanaligen kontinuierlichen und synchronisierten Video-EEG mit monopolarer, bipolarer oder gemischter Montage.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen tierischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Virginia Tech und in Übereinstimmung mit dem “Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren” der National Institutes of Health durchgeführt. . 1. Tierhandhabungsprotokoll HINWEIS: Dieses Protokoll soll Tiere, die von einem Verkäufer nach der Ankunft bestellt wurden, in die Anlage eingewöhnen und sie so ko…

Representative Results

Das hier skizzierte Protokoll beschreibt das Verfahren zur isolierten Induktion einer diffusen Verletzung (z. B. in Ermangelung einer fokalen Läsion) mit einem Mausmodell des sich wiederholenden diffusen TBI (Abbildung 1). Abbildung 1A zeigt die Gewichtsabnahmevorrichtung und ihre Komponenten ( Abbildung1A, a1-a5), die für die Induktion von TBI in diesem Modell verwendet wird, und entscheidende Sc…

Discussion

Im Gegensatz zu CCI- und FPI-Modellen, die entweder fokale oder eine Kombination von fokalen und diffusen Verletzungen induzieren, ermöglicht das in diesem Protokoll beschriebene Modell des repetitiven diffusen TBI die Induktion diffuser Verletzungen ohne fokale Hirnverletzungen und erfordert keine Kopfhaut- oder Schädelöffnungen und die damit verbundene Entzündung. Ein zusätzlicher Vorteil des Fehlens von Kraniektomie in diesem Modell ist, dass es nicht nur erlaubt, die Elektroden für chronische kontinuierliche EE…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/United States und CURE auf der Grundlage eines Stipendiums, das CURE vom United States Army Medical Research and Materiel Command, Department of Defense (DoD), im Rahmen des Forschungsprogramms für psychische Gesundheit und traumatische Hirnverletzungen unter dem Award No erhielt. W81XWH-15-2-0069. Ivan Zuidhoek wird sehr geschätzt für das Korrekturlesen des Manuskripts.

Materials

0.10" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8209 0.10 inch long stainless steel
0.10" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8403 0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8212 0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA MS333/8-A/SPC 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8201 2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide Pharmacy
3EEG headmount Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8235-SM-C custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA 060969
Buprenorphine Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA 060969
C57BL/6 mice Harlan/Envigo Laboratories Inc male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory male, 12-16 weeks old
Carprofen Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA 026357 NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic Pharmacy
Dental cement and solvent kit Stoelting Co., USA 51459
Drill Foredom HP4-917
Drill bit Meisinger USA, LLC, USA HM1-005-HP 0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer Cellpoint Scientific, USA Germinator 500
EEG System 1 Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2 Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70% VWR, USA 71001-652 KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment Pro Labs Ltd, USA Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia MWI Veterinary Supply Co., USA 502017
Hair removal product Church & Dwight Co., Inc., USA Nair cream
Isoflurane MWI Veterinary Supply Co., USA 502017
Povidone-iodine surgical solution Purdue Products, USA 004677 Betadine
Rimadyl/Carprofen Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA 026357
Solder Harware store
Soldering iron Weller, USA WP35 ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads Fisher Scientific, USA 22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads Cardinal Health, USA 3520
Tissue adhesive 3M Animal Care Products, USA 1469SB

References

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Cite This Article
Shandra, O., Robel, S. Inducing Post-Traumatic Epilepsy in a Mouse Model of Repetitive Diffuse Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (156), e60360, doi:10.3791/60360 (2020).

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