ヒト免疫シナプスのイメージング

1. ラジ細胞を付着させるスライドの調製 ウェルあたり150μLのフィブロネクチン(100μg/mL)を8マイクロウェルチャンバースライド(プラスチック底面スライド)に加え、37°Cで30分間1時間インキュベートします。この接着基板は、ラジ細胞をウェルボトム(ステップ2)に結合させ、ユルカート細胞(ステップ4)細胞との生きたコンジュゲートの形成、およびタイムラプス顕微鏡捕捉(ステップ6)を可能にし、その後、オプションのパラホルムアルデヒド(PFA)固定との互換性も有する(ステップ7)。注:アセトン固定には、アセトンがプラスチックを溶解するので、フィブロネクチンの代わりにガラス底室スライドとポリL-リジン(20μg/mL)を使用してください。8マイクロウェルチャンバースライド(1 cm2ウェル、最大容積300°L)または同等のものは、柔軟で適切なフォーマットです。 200°L自動ピペットを使用してフィブロネクチンを吸引し、穏やかな振とうで2分間200μLのPBSでそれぞれをよく洗浄します。この洗濯をもう一度繰り返します。チャンバースライドは、4°Cで1〜2週間PBSでこの段階で保存することができます。 2. チャンバースライドへのラジ細胞の接着と7-アミノ-4-クロロメチルクマリン(CMAC)標識 ラジ細胞の10 mL(1-2 x 106細胞/mL)を15mL、V底管にプレカルチャーで転写する。よく混ぜ、10°Lを使用して、ノイバウアーチャンバーまたは同等の細胞をカウントします。 残りの細胞を300 x gで遠心分離し、室温で5分間行います。吸気して上清を捨てる。 10S、2 mM グルタミン、10 mM HEPES、100 U/mL ペニシリン、および 100 g/mL ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640を106細胞/mLの濃度で穏やかに再サスペンドします。次の式を使用します。([ ]初期 x V初期= [ ]最終x V最終), ここで [ ]初期は初期細胞濃度を表し, V初期= 細胞懸濁液の初期体積, [ ] 最終 =最終細胞濃度, V最終= 細胞懸濁液の最終体積.注:開始培養の細胞濃度に応じて、必要以上に多くの細胞を採取することが可能であるが、潜在的な問題を防ぐために、実験の終わりまで培養中の残りの細胞(37°)を維持することが重要である(ステップ2.6参照)。 ラジ細胞に標識して、シナプス共役体形成中の同定を可能にする。本実験では、7-アミノ-4-クロロメチルクマリン(CMAC)標識がステップ2.4.2で行われる。 培養培地中のラジ細胞の必要数を2mLチューブに移す。8マイクロウェルチャンバースライドでは、合計1.6 mLのセルサスペンションが必要です(ウェルあたり200°L)。 CMACは光に敏感なので、アルミ箔でチューブを覆って、CMACを10μMの最終濃度に加えます。2 x 105ラジ細胞を含む 200 μL は、1 cm2ウェルごとに必要です。したがって、8つのウェルを調製する必要がある場合は、1.6 x 106 Raji細胞が必要です。注:ラジ細胞にセルトラッカーブルー(CMAC、UV励起、青色発光)でラジ細胞を標識すると、シナプスコンジュゲートが形成されるとTh細胞と区別されます。この色素はPFAおよびアセトン固定剤と互換性があり、さらなる免疫蛍光のプロシージャを可能にする。光の博覧会を避けるようにしてください。CMACを用いたプール内のラジ細胞の標識に続いて、フィブロネクチンコーティングチャンバースライドへのラジ細胞の接着前に再懸濁が行われ、異なるウェル間でCMACを有するラジ細胞の均質な標識が保証されます。 CMAC染色細胞を再懸濁し、ステップ1.2.からチャンバースライド中のPBSの吸引後、ステップ1.1〜1.2で調製したフィブロネクチン被覆チャンバースライドの各ウェルに200μLの細胞懸濁液を転写する。チャンバースライドを37°Cでインキュベートし、5%CO2を30分-1時間でインキュベートします。注:接着とCMACラベリングは、このステップで同時に発生し、時間を節約します。ラジ細胞はすぐに堆積し、播種する前に細胞懸濁液中の均質な濃度を維持するために注意が必要に注意する必要があることに注意してください。CMAC洗浄はステップ2.7でより簡単に行われるので、遠心分離によってこの段階でCMACを洗浄する必要はありません(標識されたRaji細胞がすでにチャンバースライドに付着している場合)。CMACは大過剰に細胞懸濁液中に存在するので、青色蛍光背景が高すぎて青染色細胞を区別できない。CMAC洗浄後のステップ2.7で細胞CMAC蛍光を確認してください。 ラジ細胞が顕微鏡上のチャンバースライドの穏やかな揺れによって井戸の底に付着していることを確認してください。セルが互いにギャップを表示し、コンフルでないことを確認します(図1、中央パネル)。細胞合流の50〜60%が適切である。 ほとんどの細胞がチャンバースライドに効率的に付着し、細胞の隙間が見られない場合は、温かい完全な媒体でそれぞれをよく洗い、200μLの自動ピペットで媒体を再中断して細胞過剰を剥離します。各リサスペンションステップの後に合流を確認します。 細胞が付着しない場合は、接着工程をもう一度繰り返し、接着時間や細胞数を増やします。注:ここで停止し、チャンバスライドを37°Cでインキュベートし、5%CO2を一晩(O/N)、翌日にプロトコルを継続することができる。次の日、ラジ細胞が付着したままで、蛍光顕微鏡を用いてCMAC標識を付けていることを確認してください。 温かい補完RPMIで再びよくよくよく洗い、余分なCMACを排除し、蛍光顕微鏡で青色発光をチェックします(図1)。注:浸漬油(粘着性および粘性)および高い開口油目標の使用を避けるために、超長距離(すなわち、20xまたは40x)の目的は、蛍光顕微鏡を使用してCMAC標識を迅速にチェックするために使用することができます。 3. CMACのパルス — ブドウ球菌エンテロトキシンEを有する標識ラジ細胞 ブドウ球菌エンテロトキシンE(SEE, 1μg/mL)を各ウェルに加えます。SEEは、SEE凍結ストック(PBSで1mg/mL)から細胞培養培地(100μg/mLで作動溶液)で簡便に希釈することができます。200 μL マイクロウェルあたり 100x 作動溶液の 2 μL を使用します。注意:このステップには手袋を使用し、使用した先端をバイオハザードボックスに処分します。 チャンバースライドを37°Cでインキュベートし、5%CO2を少なくとも30分間インキュベートします。SEE 効果は、少なくとも 3 ~ 4 時間続く効果があります。注:SEEは、個別のタイムラプス設定が計画されている場合(ステップ5)、および/または終点実験の開始時間点に応じて、必要に応じて異なる時点で井戸に追加することができます(ステップ6)。 4. ユルカート細胞の調製 この実験では、以前に増殖したユルカット細胞(1-2 x 106細胞/mL)を用いる。前述の23のように、標準培養フラスコまたは標準エレクトロポレーションプロトコルに続く以前のトランスフェクションからの細胞を使用する。Jurkat細胞のトランスフェクションは、生きている細胞内の分泌顆粒のトラフィックのタイムラプス可視化を可能にします。例えば、GFP-CD63(MVBのマーカー)を表現すると、GFP-CD63装飾小胞の動きを記録することができます(ビデオ1)。 位相差顕微鏡で細胞を観察する。過剰な死細胞の場合 (>20-30%)観察される、標準プロトコル24を用いてフィコール密度勾配遠心分離を行い、使用前に死細胞の過剰を排除する(死細胞は生細胞よりも高密度を示す)(ディスカッション参照)。 細胞を15mLチューブ、V底管に移し、ヘモサイトメーターを使用して計数するために10°Lを使用します。 ステップ2.2で説明したように残りの細胞を遠心分離する。上清を廃棄し、新鮮で温かい培養培地を用いてラジ細胞(1x 106/mL)と同じ濃度で細胞を再サスペンドする。手順 2.2~ 2.3 に従います。 ステップ4を待つ間、培養中のJurkat細胞(37°、5%CO2)を維持します。注:2番目のオプション(トランスフェクション)では、生きている細胞の数は最初の細胞よりもはるかに少なくなります。したがって、実験に十分な細胞を持つために、より高い開始細胞培養量を使用することを検討してください。エレクトロポレーションキュベットおよびトランスフェクションあたり10 x 106 Jurkat細胞から、トランスフェクションの48時間後に生き残る2-4 x 106 Jurkat細胞のみが生き残り、これらの細胞の一部はフィコールステップ中に失われます。したがって、1つのエレクトロポレーションキュベットは、一般に、8マイクロウェル(1.6 x 106トランスフェクトされたJurkat細胞)から付着したSEEパルスラジ細胞に挑戦するのに十分である。 5. ラジ細胞とユルカト細胞の共同播種 CMAC標識、SEEパルス、付着Raji細胞を含むチャンバースライドをステップ3.2からインキュベーターから取り出します。これはステップ 2.7 で以前に行われたため、この段階で CMAC を洗浄する必要はありません。 自動200°Lピペットを使用して井戸の一角から、各井戸の培養培地を1つずつ慎重に吸引する。よく媒体を完全に乾燥させないでください。 直ちに、ステップ4.5で調製した細胞培養培地(1 x 106/mL)の再懸濁ユルカット細胞の200μLに培地を交換します。タイムラプスイメージングが行われる場合、Jurkat細胞は堆積物を形成し、シナプスコンジュゲートを形成する傾向があるため、このステップの直後にステップ6に進みます。便宜上、SEEパルスを含むマイクロウェルは、この段階でJurkat細胞との播種を受け取らない付着Raji細胞を、Jurkat細胞とのその後の挑戦まで細胞培養培地で維持する必要があります。これにより、Jurkat細胞に対する後続のチャレンジが、追加のタイムラプスまたは逆運動、終点実験アプローチに対する回避的なアプローチが可能になります。 タイムラプスが実行される場合は、すぐにステップ6に進みます。これは、37°Cで顕微鏡ステージインキュベーターまたは同等の1〜2時間の共培養を伴い、5%CO2はシナプス共役体形成および同時画像取得を可能にする。終点分析の場合、時間経過はないが、細胞を固定する前に顕微鏡を用いて共培養期間後のチェックコンジュゲート形成を予見する(図1参照)。 6. 新興シナプスコンジュゲートのタイムラプスイメージング イメージングの前に顕微鏡とインキュベーションチャンバーを準備します。ビデオ 1 に示す例では、詳細な顕微鏡の設定を図 2に示します。注:タイムラプス実験が計画されている場合は、すべての顕微鏡設定と補体(周囲細胞培養室など)を、付着したRaji細胞を用いてチャンバースライドにユルカット懸濁液を追加する前に準備する必要があります。市販の顕微鏡 (材料の表) については、次の手順について説明します。しかしながら、細胞培養インキュベーターを備えた任意の反転蛍光顕微鏡を使用することができる。 偏光トラフィックをイメージングする際は、60倍のオイル浸漬、高い開口を備えた顕微鏡を使用してください。 自動フォーカスシステムの電源が入っていることを確認し、オフセットを調整して、底面にバインドされたRajiセルに焦点を合わせます。図 1、ビデオ1、およびビデオ 2を参照してください。 ステップ5.3で付着したRaji細胞を含む各ウェルにJurkatを加えた後、予熱(1-2時間)顕微鏡ステージインキュベーター(すなわちOKOlab)上のマイクロウェルチャンバースライドを素早く見つけ、顕微鏡でいくつかのXY位置を選択し、そのフィールド例えば、ユルカットトランスフェクト細胞が顕微鏡の焦点に落ちて作られた新しいIS形成を記録する可能性が高い。 温度安定化ステージが安定したX,Y,Z位置を維持することが観察されたので、予熱顕微鏡ステージインキュベーターを使用してください。便利なXYフィールドの基準は、よく焦点を当てた非コンフルエントラジ細胞(すなわち、細胞間のギャップを表示する)とトランスフェクトされたJurkat細胞の存在(これは透過率とUVまたはGFPチャネルを組み合わせることによって確認することができます)です。Jurkat細胞はチャンバースライド上で非常に迅速に(数分)堆積し、新しいシナプスを画像化する機会は時間とともに減少します(図1)。定義された時間経過後に実験を終了するか、ステップ7に進み、その後の免疫蛍光および分析のためにコンジュゲートを固定することができます。注:適切な時間分解能(フレームあたり1〜2分)で同時にマルチウェルタイムラプス取得のために最大4つの異なるマイクロウェルから最大16の異なる顕微鏡フィールドを選択することが可能です。この制限は、画像化される多様なフルオロクロムの数と強度(カメラの博覧会に影響を与える)の両方に依存します(CMACを除いて発現した蛍光タンパク質の数に依存します)。フレームレートを上げる 1 つの方法は、GFP の各 “n” 時間枠 (図2に示すように n = 8) のうち 1 つだけで CMAC チャネルを記録することです。さらに、これは頻繁な紫外線暴露が細胞を損傷する可能性があるため、細胞の生存率に利益をもたらす。MVB の偏光が完了するまでに数分から数時間かかるため、時間枠レートを 1 分ごと 1 分ごと (ビデオ1のフレームあたり 20 秒) に調整してください。この多チャンネルキャプチャを実行するには、電動エピ蛍光タレットと適切なバンドパス蛍光フィルタまたは同等物を搭載した顕微鏡が必要です。 7. シナプスコンジュゲートと固定の終点形成 エンドポイント実験のみが計画されている場合(シナプスコンジュゲート形成を可能にする1〜2時間のインキュベーションが適切である)、37°Cでチャンバースライドをインキュベートし、1〜2時間の5%CO2を培養期間後にコンジュゲート形成をチェックし(図1参照)、続いて、アセトンまたはPFAでコンジュゲートを固定する(固定は抗原に依存する)。この場合、インキュベーションは顕微鏡段階インキュベーターを必要としない。例については、ビデオ3を参照してください。 細胞を固定するには、FCSなしで温かいRPMI(37°)培地で穏やかに振とうして井戸を洗浄する(血清からのアルブミンはアセトン固定で沈殿することがある)。吸引し、各井戸にPFAまたは予冷アセトンの200°Lを追加します。室温(RT)または氷上でチャンバースライドをそれぞれ20分間インキュベートします。注:アセトン固定の場合は、-20°Cでアセトンを事前に冷やし、チャンバースライドを4°Cで事前に冷やします。アセトンを使用して8ウェルガラス底のチャンバースライドで培養した細胞を固定する場合は、プラスチック製の蓋を取り外します。 PBSで各ウェルを2回洗い、200°Lの焼入れ溶液(PBS、50 mM NH4Cl)を加えます。チャンバースライドを4°Cでインキュベートします。注:この段階では、チャンバースライドは、説明に従って、免疫蛍光プロトコルを実行する前に、4°Cで少なくとも1ヶ月間滞在することができる。ふたは蒸発を防ぐ。 8. 画像処理 タイムラプスシリーズおよび/または固定細胞の静止画の取得後画像デコンボリューション(すなわちホイヘンスデコンボリューションまたは同等の、材料の表)を実行します。適切なソフトウェア(すなわち、ホイヘンスの「広視野」光学オプションを使用して)と正しい光学パラメータを採用することにより、デコンボリュート。デコンボリューションは、顕微鏡4の測定点広がり関数(PSF)の画像処理に必要である。 あるいは、顕微鏡ファイルからメタデータの中に含まれる光学パラメータの自動ロードによって理想化されたPSFを計算するためにソフトウェアを使用してください。これらの光学パラメータは、フルオロクロム波長、屈折率、目的の開口数、およびイメージング技術(共焦点、広視野など)を含む4. その後、イメージングソフトウェアは、PSFと多様なデコンボリューションアルゴリズム(すなわち、HuygensソフトウェアのQMLEおよびCMLE)を段階的に累積的に計算するプロセスを使用し、その結果はユーザーが必要とする場合に継続的に視覚化および停止(または再開)することができます。この段階で、ユーザーは畳み込みの数や信号対雑音比を変更し、デコンボリューションを再開することができます。デコンボリューションソフトウェアは、タイムラプスシリーズ(X、Y、T)(ビデオ2)とZスタック(X、Y、Z)(ビデオ3)でうまく動作します。その後、デコンボリュートされたチャネルはCMACにマージされ、生チャネルは、細胞質、拡散フルオロクロムはデコンボリューション4、9によって改善されないのでである。