تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية
Summary
هنا نقوم بوصف طريقة التصوير الحي في المختبر لتصور النقل داخل الخلايا من العضيات والاتجار ببروتينات غشاء البلازما في الخلايا النجمية المورين. ويقدم هذا البروتوكول أيضا منهجية لتحليل الصور لتحديد مسارات نقل البضائع وحركيتها.
Abstract
الخلايا النجمية هي من بين أنواع الخلايا الأكثر وفرة في الدماغ الكبار، حيث أنها تلعب أدوارا رئيسية في تعدد الوظائف. كلاعب مركزي في التوازن الدماغي، توفر الخلايا النجمية الخلايا العصبية مع الأيض الحيوي والمياه العازلة خارج الخلية، والأيونات، والغلوتامات. جزء لا يتجزأ من متشابك “ثلاثي الأطراف”، والخلايا النجمية هي أيضا حاسمة في تشكيل، وتقليم، والصيانة، وتعديل نقاط الاشتباك العصبي. لتمكين هذه الوظائف التفاعلية للغاية، والخلايا النجمية التواصل فيما بينها ومع الخلايا الدبقية الأخرى، والخلايا العصبية، والأوعية الدموية الدماغ، والبيئة خارج الخلية من خلال العديد من البروتينات غشاء المتخصصة التي تشمل الخلية جزيئات التصاق، aquaporins، قنوات أيون، الناقلالعصبي، وجزيئات تقاطع الفجوة. لدعم هذا التدفق الديناميكي، تعتمد الخلايا النجمية، مثل الخلايا العصبية، على النقل داخل الخلايا المنسق والصارم. وعلى عكس الخلايا العصبية، حيث تم تحديد الاتجار داخل الخلايا على نطاق واسع، فإن النقل القائم على الأنابيب الدقيقة في الخلايا النجمية كان أقل دراسة. ومع ذلك، فإن الاتجار الخارجي والداخلي لبروتينات غشاء الخلية ونقل الأعضاء داخل الخلايا ينظم البيولوجيا الطبيعية للخلايا النجمية، وغالبا ً ما تتأثر هذه العمليات بالمرض أو استجابة للإصابة. هنا نقدم بروتوكول اعلام يُقدم مباشرة للثقافة ذات جودة عالية من الخلايا النجمية، لتسمية البروتينات الفلكية والعضيات ذات الأهمية، وتسجيل ديناميات النقل داخل الخلايا باستخدام الفحص المجهري البؤري الفاصل زمنياً. كما نبين كيفية استخراج وتحديد معايير النقل ذات الصلة من الأفلام المكتسبة باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة (أي ImageJ /FIJI) الإضافات.
Introduction
الخلايا النجمية هي الخلايا الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي للبالغين، حيث أنها تؤدي وظائف تنموية ومنزلية فريدةمننوعها 1. Astrocytes تحوير تطوير متشابك من خلال الاتصال المباشر مع محطات ما قبل وpostsynaptic كجزء من متشابك ثلاثي الأطراف، والذي يحتوي على مستقبلات الناقل العصبي، وناقلات، وجزيئات التصاق الخلايا التي تسهل تشكيل متشابك والخلايا العصبية-astrocyte الاتصالات2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا النجمية تتحكم بنشاط في انتقال متشابك ومنع السمية الطاردة للخلايا العصبية عن طريق إزالة الناقلات العصبية المحفزة بسرعة من المشقوق متشابك، وإعادة تدوير الناقلات العصبية، والمشاركة في تقليم متشابك3 , 4 , 5 , 6.لتمكين هذه الوظائف التفاعلية للغاية، والخلايا النجمية التواصل فيما بينها، مع الخلايا الدبقية الأخرى، ومع الخلايا العصبية من خلال بروتينات الغشاء المتخصصة، بما في ذلك جزيئات التصاق الخلية، aquaporins، قنوات أيون، الناقل العصبي، وجزيئات تقاطع الفجوة. الخلايا النجمية تغير بنشاط مستويات سطح هذه البروتينات استجابة للتقلبات في بيئتها داخل الخلايا وغير الخلوية7. وعلاوة على ذلك، فإن التغيرات في مستويات وتوزيع الميتوكوندريا، قطرات الدهون، والعضيات المهينة وإعادة التدوير تحوير إمدادات الطاقة، وتوافر المستقلب، وعمليات المقاصة الخلوية التي تعتبر ضرورية لوظيفة الخلايا النجمية و بقاء.
يتم تسهيل التغيرات الديناميكية في الاتجار ببروتين الغشاء وorganelle وتحديد المواقع في الخلايا النجمية من خلال وظيفة منسقة من البروتينات الحركية ومحولات التي تعزز حركة البضائع8،9. وبالمثل، يتم تعديل مستويات السطح من بروتينات الغشاء من خلال الاستيعاب وإعادة التدوير الأحداث10. يتم نقل هذه الشحنات عن طريق شبكة معقدة من الأكتين، microtubules، وربما خيوط وسيطة المسارات8. تشير الدراسات المستندة إلى تلطيخ الفلورة المناعية للبروتين النهائي الملزم 1 (EB1)، الذي يتراكم في الأنابيب الدقيقة المتنامية بالإضافة إلى النهايات، إلى أنه في حزم الخلايا النجمية من الأنابيب الدقيقة تشع من النوى المحيطية وتمتد نهايتها الزائدة نحو محيط11. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص في الفحص الشامل لتنظيم وقطبية الأنابيب الدقيقة وغيرها من العناصر الخلوية الهيكلية باستخدام التصوير بالخلايا الحية. في حين أن العديد من الآليات الكامنة وراء ديناميات العضيات والبروتينات الغشاء قد درست على نطاق واسع في الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى، وحركة البضائع في الخلايا النجمية هو أقل فهما جيدا. ويستند معظم معرفتنا الحالية حول التغيرات في توزيع البروتين والجهاز في الخلايا النجمية على وضع العلامات التقليدية المستندة إلى الأجسام المضادة من إعداد ثابت، مما يحول دون الفحص المكاني والزمني الدقيق لديناميات البضائع7، 12.
هنا، ونحن نصف طريقة لتسمية البروتينات غشاء والعضيات للتصوير الحي في الثقافات الماوس التبويض ة الأولية عالية النقاء. باستخدام هذا البروتوكول، نقدم أمثلة نتتبع فيها التوطين الديناميكي للبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) – البروتينات الغشاء الموسومة في الخلايا النجمية المنقولة، بما في ذلك تقاطع الفجوة البروتين connexin 43 (Cx43-GFP) والأحماض الأمينية المحفزة الناقل 1 (EAAT1-GFP). كما نوصف استخدام مسبار حمضي فلورسنت لتصور العضيات الحمضية واتباع ديناميات الاتجار بها في الخلايا النجمية الحية. وأخيرا، نبين كيفية تحليل بيانات الفاصل الزمني لاستخراج وتقييم بارامترات النقل لفرادى الشحنات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، ونحن نصف نهج تجريبي للتعبير عن، تصور، وتتبع الفلورسنت الموسومة العضيات والبروتينات غشاء ذات أهمية باستخدام مجهريالفيديو الفاصل الزمني في عالية النقاء الأولية الماوس القشرية MD astrocytes. كما نحدد منهجية لقياس ديناميات الجسيمات. التصور المباشر للبروتين وديناميات الجهاز ية في الخلايا ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
[دينل] كان ساندت بالجامعة [نورث كرولينا] في كنيسة صغيرة تل ([أونك]) مدرسة الطبّ كسيمونز طالبة. وحظيت هذه الاستجابة بدعم من المنحة المقدمة من لجنة الأمم المتحدة للاستجابة إلى البيئة R25 GM089569. تم دعم العمل باستخدام المرفق الأساسي للميكروسكوب مركز علم الأعصاب التابع لقيادة الأمم المتحدة، جزئياً، بتمويل من منحة دعم مركز العلوم العصبية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية – NINDS P30 NS045892، ومنحة دعم مركز أبحاث الإعاقة الفكرية والتنموية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية HD079124.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
- Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
- Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).
- Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
- Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
- Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
- Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
- Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).
- Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
- Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
- . IJ KymoToolBox Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016)
