Gli organoid della prostata del topo rappresentano un contesto promettente per valutare i meccanismi che regolano la differenziazione. Questo documento descrive un approccio migliorato per stabilire gli organoidi della prostata e introduce metodi per (1) raccogliere il lisato proteico dagli organoidi e (2) fissare e macchiare gli organoidi per la microscopia confocale a cavalcatura completa.
L’epitelio della prostata è costituito prevalentemente da cellule basali e luminali. Il tracciamento del lignaggio in vivo è stato utilizzato per definire la capacità di differenziazione delle cellule basali e luminose della prostata del topo durante lo sviluppo, la rigenerazione dei tessuti e la trasformazione. Tuttavia, la valutazione dei regolatori intrinseci ed estrinseci delle cellule della capacità di differenziazione epiteliale della prostata utilizzando un approccio di tracciamento del lignaggio spesso richiede un’ampia riproduzione e può essere proibitiva in termini di costi. Nel saggio organoide della prostata, le cellule basali e luminali generano epitelio prostatico ex vivo. È importante sottolineare che le cellule epiteliali primarie possono essere isolate da topi di qualsiasi background genetico o topi trattati con un numero qualsiasi di piccole molecole prima o dopo la placcatura in coltura tridimensionale (3D). Materiale sufficiente per la valutazione della capacità di differenziazione viene generato dopo 7-10 giorni. La raccolta di organoidi derivati e luminali per l’analisi delle proteine (1) da parte dell’analisi immunohistochimica occidentale e (2) degli organoitidi intatti mediante microscopia confocale a monte completa consente ai ricercatori di valutare la differenziazione ex vivo capacità delle cellule epiteliali della prostata. Se utilizzati in combinazione, questi due approcci forniscono informazioni complementari sulla capacità di differenziazione delle cellule comportamentali e luminose in risposta alla manipolazione genetica o farmacologica.
Le cellule basali e luminali costituiscono la maggior parte dell’epitelio prostatico1. Studi di tracciamento del lignaggio hanno rivelato che questi tipi di cellule sono prevalentemente autosufficienti da progenitori distinti nel topo adulto2; tuttavia, la differenziazione luminale da progenitori basali è stata osservata in diversi contesti tra cui lo sviluppo3,4, la rigenerazione dei tessuti5, l’infiammazione6,7 e l’avvio del cancro alla prostata2,8. Inoltre, i dati emergenti supportano l’esistenza di progenitori luminali multipotenti e di progenitori luminosi9. Nel cancro della prostata metastatica, la differenziazione da un lignaggio luminale dipendente dall’AR a un lignaggio INdifferente AR con caratteristiche basali e neuroendocrine rappresenta un meccanismo sempre più apprezzato di resistenza agli inibitori della via androgenia10,11,12. Pertanto, poiché la differenziazione è implicata nella fisiologia normale, l’avvio del cancro e la resistenza alla terapia, è fondamentale chiarire i regolatori molecolari chiave della differenziazione delle cellule epiteliali della prostata.
Il modello organoide della prostata del topo è emerso come un elegante contesto ex vivo per studiare la differenziazione delle cellule epiteliali della prostata9,13,14. In questo saggio, le singole cellule epiteliali sono placcate in una matrice 3D dove generano strutture ghiandolari contenenti cellule basali e luminali entro 1 settimana. Mentre gli approcci esistenti per la placcatura delle cellule in coltura organoide possono essere utilizzati per generare in modo efficiente organoidi, questi approcci richiedonoun’ulterioreottimizzazione 14 . Le sfide più importanti associate alla coltura degli organoidi della prostata includono (1) colonie bidimensionali (2D) che si formano sotto il Matrigel (gel a matrice) dall’analisi, (2) mantenendo l’integrità del gel della matrice durante i cambiamenti dei supporti e (3) il conteggio degli organoidi con precisione. Questo documento delinea un approccio per generare organoidi da cellule epiteliali isolate dalla prostata del topo. L’approccio descritto prevede il rivestimento di piastre con poli(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) per prevenire il verificarsi di colonie 2D. Inoltre, le cellule sono placcate in un anello gel a matrice, piuttosto che in un disco gel a matrice, che rende meno difficile cambiare i supporti e contare gli organoidi. Queste tecniche consentono ai ricercatori di studiare più facilmente il modo in cui le alterazioni genetiche o piccole molecole introdotte prima o durante la formazione di organoidi alterano i processi chiave come la differenziazione.
La raccolta degli organoidi della prostata per l’analisi delle macchie o immunohistochimiche occidentali mediante microscopia confocale integrale può fornire preziose informazioni meccanicistiche sulla differenziazione13, ma mancano protocolli consolidati per preparare gli organoid per tali tecniche. Questo manoscritto descrive gli approcci per raccogliere gli organoidi per (1) la raccolta di proteine lisate, o (2) fissazione e colorazione per la microscopia confocale. È importante sottolineare che l’approccio descritto per fissare e colorare gli organoid della prostata è notevolmente migliorato in relazione ai metodi esistenti. Mentre questi si basano sulla sezionamento organoids15, il metodo descritto in questo manoscritto utilizza organoidi intatti, che aiuta a proteggere contro danni organoidi durante la preparazione del campione. Se utilizzato in combinazione, la microscopia confocale e macchia occidentale può fornire preziose informazioni sui regolatori molecolari della differenziazione. In alternativa, questi approcci possono essere utilizzati per modellare altri processi, ad esempio lo sviluppo e la trasformazione.
La differenziazione delle cellule epiteliali della prostata è stata implicata sia nella normale biologia della prostata2,3,4,5,6,e biologia della malattia8,10,11,12; tuttavia, le autorità di regolamentazione principali di questo processo rimangono indefinite. Identificare i regolatori chiave della differenziazione delle cellule epiteliali della prostata è stato difficile in parte a causa dell’assenza di contesti consolidati per modellarlo. Mentre la coltura monostrato 2D può essere utilizzata per modellare la differenziazione11,12, questo contesto non riesce a ricapitolare il complesso microambiente della prostata. Inoltre, i contesti in vivo per modellare la differenziazione non si prestano agli studi meccanicistici, in quanto sono difficili da manipolare. Pertanto, l’identificazione di un contesto facile da manipolare, ma fisiologicamente rilevante, per studiare la differenziazione è fondamentale.
Il modello organoide della prostata rappresenta un elegante contesto ex vivo in cui si segnala una differenziazione basale a luminale. I metodi per stabilire gli organoidi della prostata sono ben stabiliti14; tuttavia, è necessaria un’ulteriore ottimizzazione di questi metodi. Inoltre, gli approcci per raccogliere e preparare gli organoidi della prostata per l’analisi non sono chiaramente descritti. Questo documento descrive un approccio alle cellule epiteliali della prostata a lamiche isolate dalla prostata del topo in coltura organoide. Questo approccio consente ai ricercatori di (1) prevenire il verificarsi di colonie 2D durante la formazione di organoidi, (2) ridurre il rischio di interruzione del gel di matrice durante il rifornimento dei media e (3) contare gli organoidi in modo più efficace. Inoltre, questo manoscritto delinea approcci per raccogliere gli organoidi per la preparazione per l’analisi delle macchie occidentali, o microscopia confocale a tutto monte. È importante sottolineare che l’approccio utilizzato per preparare gli organoidi per la microscopia confocale mantiene la struttura intatta degli organoidi per tutta la sua durata, riducendo i danni agli organiidi prima dell’acquisizione dell’immagine. Complessivamente, gli approcci descritti ampliano le capacità dell’analisi organoide della prostata.
In particolare, la capacità di formazione organoide delle cellule basali e luminali può essere alterata sia con metodi utilizzati per isolare le rispettive popolazioni, sia mediante condizioni di coltura. Le condizioni di coltura organoide usate in questo saggio sono state descritte per la prima volta da Karthaus et al.13. Mentre Karthaus et al. hanno riferito che le cellule basali hanno una maggiore capacità di formatura organoide (15%) rispetto alle cellule luminali (1%)13, Chua e altri, utilizzando metodi di isolamento distinti e condizioni di coltura, hanno riferito che le cellule luminali (0,2-0,3%) hanno una capacità di formazione organoide più elevata rispetto alle cellule basali (0,03%)20. Complessivamente, i metodi descritti da Karthaus et al. portano a tassi di formazione organoidi più elevati per le cellule basali e luminose, probabilmente riflettendo le differenze nell’approccio utilizzato per isolare le cellule basali e luminose13, in contrapposizione a condizioni di coltura che sbilanciano contro la formazione di organiidi dalle cellule luminose. Non è chiaro se il protocollo descritto in questo manoscritto favorisca la formazione di organidici luminali da progenitori luminosi multipotenti o progenitori comminati9. Anche se tempestivi e proibitivi in termini di costi, gli studi di tracciamento del lignaggio in vivo possono essere utilizzati per convalidare le caratteristiche progenitorie associate a linee epiteliali prostate distinte chiarite nel saggio organoide.
Processi come lo sviluppo, la differenziazione e la trasformazione non sono rilevanti solo per la biologia della prostata, ma anche rilevanti per la biologia di altri tessuti tra cui il cervello, il polmone, l’intestino, il pancreas e il fegato. I metodi descritti facilitano l’utilizzo del modello organoide per studiare questi processi non solo nella prostata, ma anche in una vasta gamma di tessuti.
The authors have nothing to disclose.
PDC e JMG sono supportati dal Ruth L. Kirschstein National Research Service Award GM007185. JAD è supportato dal National Institute of General Medical Sciences dei National Institutes of Health (R25GM055052) assegnato a T. Hasson e alla borsa di studio Saul Martinez. ASG è sostenuta dallo Spitzer Family Foundation Fund e dal Gill Endowment. Questo lavoro è stato supportato dalla American Cancer Society (RSG-17-068-01-TBG), Department of Defense (W81XWH-13-1-0470), Margaret E. Presto Medical Research Trust, NIH/NCI (P50CA092131/UCLA SPORE in Prostate Cancer), Rose Hills Foundation e il supporto del Jonsson Comprehensive Cancer Center di UCLA, del Broad Stem Cell Research Center, dell’Istituto di Scienze Cliniche e Traslazionali e dell’Istituto di Oncologia Urologica.
µ-Dish 35mm, high | ibidi | 81156 | |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 ug | BioLegend | 118218 | |
B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
(DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 102405 | |
FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 103107 | |
FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 116205 | |
Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |