Quantificazione delle dinamiche della rete di interazione proteica mediante co-immunoprecipitazioni multiplexate
Summary
L’immunoprecipitazioni quantitativa multiplex (QMI) utilizza la citometria di flusso per rilevare sensitivemente le differenze nell’abbondanza di interazioni mirate proteina-proteina tra due campioni. QMI può essere eseguita utilizzando una piccola quantità di biomateriale, non richiede tag geneticamente ingegnerizzati e può essere adattato per qualsiasi rete di interazione proteica definita in precedenza.
Abstract
Le interazioni dinamiche proteina-proteina controllano il comportamento cellulare, dalla motilità alla replicazione del DNA alla trasduzione del segnale. Tuttavia, il monitoraggio delle interazioni dinamiche tra più proteine in una rete di interazione proteica è tecnicamente difficile. Qui presentiamo un protocollo per l’immunoprecipitazioni Quantitative Multiplex (QMI), che consente la valutazione quantitativa dei cambiamenti di piegatura nelle interazioni proteiche sulla base delle misurazioni relative a fluorescenza delle proteine nei complessi condivisi rilevate da Exposed Epitopi di superficie (PiSCES). Nel QMI, i complessi proteici da lismi cellulari sono immunoprecipitati sulle microsfere, e quindi sondati con un anticorpo etichettato per una proteina diversa al fine di quantificare l’abbondanza di PiSCES. Gli anticorpi dell’immunoprecipitazioni sono coniugati a diverse regioni spettrali MagBead, il che consente a un citometro di flusso di differenziare più immunoprecipitazioni parallele e quantificare simultaneamente la quantità di anticorpi sonda associati a ciascuna di esse. QMI non richiede l’etichettatura genetica e può essere eseguita utilizzando un biomateriale minimo rispetto ad altri metodi di immunoprecipitazioni. QMI può essere adattato per qualsiasi gruppo definito di proteine interagenti, ed è stato finora utilizzato per caratterizzare le reti di segnalazione nelle cellule T e sinapsi glutammato neuronale. I risultati hanno portato alla generazione di nuove ipotesi con potenziali applicazioni diagnostiche e terapeutiche. Questo protocollo include istruzioni per eseguire QMI, dalla selezione iniziale del pannello anticorpale fino all’esecuzione di saggi e all’analisi dei dati. L’assemblaggio iniziale di un saggio QMI prevede lo screening di anticorpi per generare un pannello e la determinazione empirica di un buffer di lisi appropriato. La successiva preparazione del reagente comprende anticorpi di immunoprecipitazioni covalentmente di accoppiamento a MagBeads, e anticorpi della sonda biotinylante in modo che possano essere etichettati da un fluoroforo coniugato di streptavidin. Per eseguire il saggio, il lisato viene mescolato con MagBeads durante la notte, e poi le perle sono divise e incubate con diversi anticorpi della sonda, quindi un’etichetta di fluoroforo, e lette per citometria di flusso. Vengono eseguiti due test statistici per identificare i PiSCES che differiscono in modo significativo tra le condizioni sperimentali e i risultati vengono visualizzati utilizzando mappe di calore o diagrammi node-edge.
Introduction
Le interazioni dinamiche proteina-proteina costituiscono le cascate di segnalazione molecolare e le strutture motili che sono la base funzionale della maggior parte della fisiologia cellulare1. Questi processi sono spesso raffigurati come percorsi di segnalazione lineare che passano tra stati costanti basati su singoli input, ma i dati sperimentali e di modellazione mostrano chiaramente che funzionano come reti integrate2,3, 4.Nel caso delle proteine G, recettori diversi hanno spesso la capacità di attivare la stessa proteina G, e un singolo recettore può anche attivare più di un tipo di proteina G5,6. Affinché il numero relativamente ridotto di classi di proteine G modifichi specificamente una vasta gamma di funzioni cellulari come la trasmissione sinaptica, la regolazione ormonale e la migrazione cellulare, le cellule devono integrare e differenziare questi segnali4 , 5. Le prove hanno dimostrato che questa specificità del segnale, sia per le proteine G che per altre, è derivata principalmente sulla base di interazioni proteina-proteina finemente sintonizzate e della loro dinamica temporale1,3, 4 DEL psu’ , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7. Poiché le reti di segnalazione sono costituite da complessi proteici dinamici con più ingressi, uscite e cicli di feedback, una singola perturbazione ha l’opportunità di modificare l’equilibrio omeostatico complessivo della fisiologia di una cellula4 ,7. È ormai ampiamente convenuto che la segnalazione dovrebbe essere esaminata da una prospettiva di rete al fine di comprendere meglio come l’integrazione di più ingressi controlla le funzioni cellulari discrete in salute e malattia7,8, 9,10,11,12,13. Alla luce di ciò, Quantitative Multiplex Immunoprecipitazionation (QMI) è stato sviluppato per raccogliere dati quantitativi di media velocità media sulle dimensioni sui cambiamenti di piegatura nelle reti di interazione dinamica delle proteine.
QMI è un saggio basato su anticorpi in cui il lisa cellulare è incubato con un pannello di anticorpi di immunoprecipitazioni che sono covalentmente accoppiati a perline magnetiche contenenti rapporti distinti di coloranti fluorescenti. Avere anticorpi specifici accoppiati a classi di perline magnetiche distinte consente la co-immunoprecipitazioni simultanea di più proteine bersaglio dallo stesso lisato. Dopo l’immunoprecipitazioni (IP), le perle magnetiche vengono incubate con un secondo anticorpo sonda coniugato a fluoroforo (o anticorpo biotinyato in combinazione con streptavidina coniugata a fluoroforo). Le co-associazioni tra le proteine riconosciute da ogni coppia di anticorpi anticorpi IP, o PiSCES (proteine in complessi condivisi rilevati da epitopes di superficie esposta), vengono poi rilevate dalla citometria di flusso e possono essere confrontate quantitativamente tra diversi condizioni del campione14. Le illustrazioni nella Figura 1 mostrano i passaggi coinvolti nell’esecuzione di un test QMI, incluso un diagramma di perline magnetiche con complessi proteici immunoprecipitati etichettati da anticorpi della sonda coniugati fluorescentmente (Figura 1C).
La sensibilità del QMI dipende dalla concentrazione proteica del lisato rispetto al numero di perline magnetiche utilizzate per l’immunoprecipitazioni e il raggiungimento di una risoluzione per rilevare i cambiamenti del 10% richiede solo una piccola quantità di materiale iniziale rispetto ad altri metodi di co-IP14,15. Ad esempio, la quantità di materiale di partenza utilizzato in QMI è simile a quella richiesta per un sandwich Enzima-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), ma vengono rilevate più interazioni in un singolo test QMI. I saggi QMI utilizzando 20 IP e 20 obiettivi di sonda sono stati eseguiti utilizzando 1-5 x 105 cellule T primarie isolate da una biopsia cutanea di 4 mm, preparazioni sinaptosomiche P2 da una sezione coronale da 3 mm della corteccia prefrontale del topo, o 3 x 106 cellule primarie di topo coltivate neuroni corticali14,16,17. Questa sensibilità rende QMI utile per l’analisi di cellule o tessuti con disponibilità limitata, come campioni clinici.
QMI può essere adattato per qualsiasi rete di interazione proteica definita in precedenza (a condizione che siano disponibili anticorpi), e ad oggi è stato sviluppato per analizzare il signaloso del recettore dell’antigene della cellula T (TCR) e un sottoinsieme di proteine nelle sinapsi glutamatergiche nei neuroni 17 mi lato , 18.Negli studi sulla segnalazione del recettore delle cellule T, QMI è stato utilizzato per identificare i cambiamenti indotti dalla stimolazione in PiSCES, e poi per distinguere i pazienti autoimmuni da un gruppo di controllo, rilevare la segnalazione autoimmune endogena e infine per generare un l’ipotesi che coinvolga una sottorete di interazioni associata alla malattia sbilanciata14. Più recentemente, lo stesso pannello QMI è stato utilizzato per determinare che la selezione dei timociti è determinata da differenze quantitative piuttosto che qualitative nella segnalazione proteica associata al TCR19. Nei neuroni, QMI è stato utilizzato per descrivere il riarrangiamento specifico dell’input di una rete di interazione proteica per tipi distinti di segnali di ingresso in un modo che supporta i nuovi modelli emergenti di plasticità sinaptica17. Inoltre, questo pannello sinaptico QMI è stato utilizzato per identificare le differenze in sette modelli murini di autismo, raggruppare i modelli in sottogruppi in base alle loro biofirme PiSCES e ipotizzare con precisione un deficit molecolare condiviso che in precedenza non era riconosciuto in uno dei modelli16. Un approccio simile potrebbe essere utilizzato per controllare altri sottogruppi che potrebbero rispondere a diversi trattamenti farmacologici o assegnare farmaci a specifici sottogruppi reattivi. QMI ha potenziali applicazioni nella diagnostica, sotto-tipizzazione dei pazienti e sviluppo di farmaci, oltre alla scienza di base.
Per assemblare un pannello anticorpo QMI, lo screening iniziale degli anticorpi e i protocolli di selezione sono descritti nella Sezione 1, di seguito. Una volta identificati i pannelli anticorpi, i protocolli per la coniugazione degli anticorpi selezionati alle perline magnetiche per ip e per la biotinylazione degli anticorpi della sonda selezionati sono descritti nella sezione 2. Il protocollo per l’esecuzione del saggio QMI sulle lisature di cellule o tessuti è descritto nella Sezione 3. Infine, poiché un singolo esperimento può generare 5 x 105 punti dati individuali, istruzioni e codici informatici per facilitare l’elaborazione, l’analisi e la visualizzazione dei dati sono forniti nella Sezione 4. Una panoramica del flusso di lavoro descritto nelle sezioni 2-4 è illustrata nella Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test QMI richiede notevoli investimenti nello sviluppo, nelle attrezzature e nei reagenti dei pannelli anticorpi, ma una volta stabilito il test, si possono raccogliere dati ad alta dimensione osservando le reti di interazione delle proteine mentre rispondono ai controlli sperimentali Stimoli. Tecnicamente, QMI richiede un’attenta pipettatura e tracciamento delle posizioni dei pozzi di campioni e anticorpi. È utile etichettare con attenzione le lastre di analisi, così come un modello dettagliato di posizioni dei poz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere Tessa Davis per importanti contributi allo sviluppo dei saggi QMI e per gli attuali ed ex membri dei laboratori Smith e Schrum per l’orientamento tecnico e l’input intellettuale. Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni NIMH R01 MH113545 e R00 MH 102244.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
References
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
- Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
- Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
- Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
- Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
- Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
- Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
- Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
- Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science’s STKE. 2007 (389), (2007).
- Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
- Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
- Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
- Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
- Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
- Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).
