القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد
Summary
يستخدم الترسيب المناعي المتعدد الكمية (QMI) قياس التدفق الخلوي للكشف الحساس عن الاختلافات في وفرة التفاعلات المستهدفة بين البروتين والبروتين بين عينتين. يمكن إجراء QMI باستخدام كمية صغيرة من المواد الحيوية، ولا يتطلب علامات هندسية وراثيا، ويمكن تكييفها لأي شبكة تفاعل البروتين المحددة سابقا.
Abstract
تتحكم التفاعلات الديناميكية بين البروتين والبروتين في السلوك الخلوي، من الحركة إلى النسخ المتماثل للحمض النووي إلى تحويل الإشارة. ومع ذلك، فإن رصد التفاعلات الديناميكية بين البروتينات المتعددة في شبكة تفاعل البروتين أمر صعب من الناحية التقنية. هنا، نقدم بروتوكول اتونى الكمية متعددة المناعة (QMI)، والذي يسمح بالتقييم الكمي للتغيرات أضعاف في تفاعلات البروتين على أساس قياسات الفلورة النسبية من البروتينات في المجمعات المشتركة التي تم الكشف عنها من قبل يتعرض الepitopes السطحية (PiSCES). في QMI، يتم تسريع مجمعات البروتين من الليسات الخلوية المناعية على الميكروسفيرات، ومن ثم يتم فحصها بجسم مضاد مسمى لبروتين مختلف من أجل تحديد كمية وفرة PiSCES. يتم الجمع بين الأجسام المضادة الترسيب المناعي إلى مناطق الطيفية MagBead مختلفة، مما يسمح لمقياس التدفق للتمييز بين الترسيب المناعي الموازي المتعدد وتحديد كمية الأجسام المضادة للمسبار المرتبطة بكل منها في نفس الوقت. لا يتطلب QMI وضع علامات وراثية ويمكن القيام به باستخدام الحد الأدنى من المواد الحيوية مقارنة بأساليب الترسيب المناعي الأخرى. يمكن تكييف QMI لأي مجموعة محددة من البروتينات المتفاعلة، وقد استخدمت حتى الآن لوصف شبكات الإشارات في الخلايا T ونقاط الاشتباك العصبية الغلوتامات. وقد أدت النتائج إلى توليد فرضية جديدة مع التطبيقات التشخيصية والعلاجية المحتملة. يتضمن هذا البروتوكول إرشادات لتنفيذ QMI، من التحديد الأولي للوحة الأجسام المضادة حتى تشغيل الاختبارات وتحليل البيانات. التجميع الأولي لفحص QMI ينطوي على فحص الأجسام المضادة لإنشاء لوحة، وتحديد تجريبيا ً المخزن المؤقت للlysis المناسب. ويشمل إعداد الكاشف اللاحق اقتران الأجسام المضادة لهطول الأمطار المناعية إلى MagBeads، والأجسام المضادة التحقيق biotinylating بحيث يمكن وصفها من قبل الفلوروفور مترافق streptavidin. لتشغيل فحص، يتم خلط lysate مع MagBeads بين عشية وضحاها، ومن ثم يتم تقسيم الخرز وحضانة مع الأجسام المضادة التحقيق مختلفة، ومن ثم تسمية فلوروفور، وقراءة من قبل قياس التدفق. يتم إجراء اختبارين إحصائيين لتحديد PiSCES التي تختلف بشكل كبير بين الظروف التجريبية، ويتم تصور النتائج باستخدام خرائط الحرارة أو الرسومات التخطيطية على حافة العقدة.
Introduction
التفاعلات الديناميكية بين البروتين والبروتين تشكل سلاسل الإشارات الجزيئية والهياكل motile التي هي الأساس الوظيفي لمعظم علم وظائف الأعضاء الخلوية1. وغالبا ما تصور هذه العمليات على أنها مسارات الإشارات الخطية التي تحول بين الدول الثابتة على أساسمدخلات واحدة، ولكن البيانات التجريبية والنمذجة تبين بوضوح أنها تعمل كشبكات متكاملة 2،3، 4.في حالة البروتينات G, مستقبلات مختلفة غالبا ما يكون القدرة على تنشيط نفس البروتين G, ومستقبلات واحدة يمكن أيضا تنشيط أكثر من نوع واحد من البروتين G5,6. من أجل عدد صغير نسبيا من فئات البروتين G لتعديل على وجه التحديد مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية مثل انتقال متشابك, تنظيم هرمون, وهجرة الخلايا, الخلايا يجب على حد سواء دمج وتمييز هذه الإشارات4 , 5.وقد أظهرت الأدلة أن هذه الخصوصية إشارة، للبروتينات G وغيرها، وتستمد في المقام الأول على أساس التفاعلات البروتين البروتين ضبطها بدقة ودينامياتها الزمنية 1،3، 4 , 5 , 6 , 7.لأن شبكات الإشارات تتكون من مجمعات البروتين الديناميكي مع مدخلات متعددة، والمخرجات، وحلقات التغذية المرتدة، اضطراب واحد لديه الفرصة لتغيير التوازن المنزلي العام من علم وظائف الأعضاء الخلية4 ،7. ومن المتفق عليه الآن على نطاق واسع أنه ينبغي فحص الإشارات من منظور الشبكة من أجل فهم أفضل لكيفيةدمج المدخلات المتعددة يتحكم في الوظائف الخلوية المنفصلة في الصحة والمرض 7،8، 9،10،11،12،13. في ضوء ذلك، تم تطوير الكم ّي متعددة المناعة (QMI) لجمع متوسطة الإنتاجية، والبيانات الكمية حول التغيرات أضعاف في شبكات التفاعل البروتين الديناميكي.
QMI هو فحص يستند إلى الأجسام المضادة حيث يتم احتضان الليسات الخلية مع لوحة من الأجسام المضادة لهون الأمطار المناعية التي تقترن بشكل مشترك إلى الخرز المغناطيسي التي تحتوي على نسب متميزة من الأصباغ الفلورية. وجود أجسام مضادة محددة إلى جانب فئات حبة المغناطيسي متميزة يسمح لمتزامنة co-immunoprecipitation من البروتينات المستهدفة متعددة من نفس lysate. بعد هطول الأمطار المناعية (IP)، يتم احتضان الخرز المغناطيسي مع ثاني، جسم مضاد للمسبار الفلوري المترافق (أو الأجسام المضادة biotinylated جنبا إلى جنب مع streptavidin الفلوروفوري المترافق). ثم يتم الكشف عن الارتباطات المشتركة بين البروتينات المعترف بها من قبل كل زوج الأجسام المضادة للأجسام IP، أو PiSCES (البروتينات في المجمعات المشتركة التي تم الكشف عنها من قبل epitopes السطح المكشوفة)، عن طريق قياس التدفق ويمكن مقارنتها كميا بين مختلف عينة الشروط14. تُظهر الرسوم التوضيحية في الشكل 1 الخطوات التي ينطوي عليها إجراء فحص QMI، بما في ذلك رسم تخطيطي للحبات المغناطيسية مع مجمعات البروتين المُعفية المناعية التي تحمل هالاً مضادة للمسبار المترافق بشكل فلوري (الشكل1C).
حساسية QMI يعتمد على تركيز البروتين من lysate نسبة إلى عدد من الخرز المغناطيسي المستخدمة لمناعة الترسيب، وتحقيق قرار للكشف عن 10٪ أضعاف التغييرات يتطلب سوى كمية صغيرة من المواد البداية بالمقارنة مع غيرها من أساليب الملكية الفكرية المشتركة14،15. على سبيل المثال، كمية المواد الأولية المستخدمة في QMI مشابهة لتلك المطلوبة لشطيرة مرتبطة بالإنزيم المناعيSorbent الفحص (ELISA)، ولكن يتم الكشف عن تفاعلات متعددة في الفحص QMI واحد. تم إجراء فحص QMI باستخدام 20 نقطة IPs و20 هدف مسبار باستخدام 1-5 × 105 خلايا T الأولية معزولة عن خزعة الجلد 4 مم، والاستعدادات متشابك P2 من قسم الإكليل 3 مم من القشرة الأمامية للماوس، أو 3 × 106 الماوس المستزرع الابتدائي الخلايا العصبية القشرية14،16،17. هذه الحساسية تجعل QMI مفيدة لتحليل الخلايا أو الأنسجة ذات التوافر المحدود، مثل العينات السريرية.
يمكن تكييف QMI لأي شبكة تفاعل بروتين محددة مسبقًا (شريطة أن تكون الأجسام المضادة متوفرة)، وقد تم تطويرها حتى الآن لتحليل مستقبلات مستضد الخلايا T (TCR) الإشارة ومجموعة فرعية من البروتينات في نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاساتفية في الخلايا العصبية 17 سنة , 18.في دراسات إشارات مستقبلات الخلايا T، تم استخدام QMI لأول مرة لتحديد التغيرات الناجمة عن التحفيز في PiSCES، ومن ثم للتمييز بين مرضى المناعة الذاتية من مجموعة التحكم، والكشف عن إشارات المناعة الذاتية الذاتية، وأخيرا لتوليد فرضية تنطوي على شبكة فرعية غير متوازنة المرتبطة بالمرض من التفاعلات14. في الآونة الأخيرة، تم استخدام نفس لوحة QMI لتحديد أن يتم تحديد الخلايا الصعترية من خلال الاختلافات الكمية بدلا من النوعية في البروتين المرتبط بـ TCR مما يشيرإلى 19. في الخلايا العصبية، تم استخدام QMI لوصف إعادة ترتيب المدخلات المحددة لشبكة تفاعل البروتين لأنواع متميزة من إشارات الإدخال بطريقة تدعم النماذج الناشئة حديثا من اللدونة متشابك17. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام لوحة QMI متشابك لتحديد الاختلافات في سبعة نماذج الماوس من التوحد، وتجميع النماذج في مجموعات فرعية على أساس التوقيعات الحيوية PiSCES الخاصة بهم، ويفترض بدقة العجز الجزيئي المشترك الذي لم يتم التعرف عليه سابقا في واحدة من النماذج16. ويمكن استخدام نهج مماثل لفحص المجموعات الفرعية الأخرى التي قد تستجيب لمختلف علاجات المخدرات، أو لتعيين عقاقير لمجموعات فرعية متجاوبة محددة. QMI لديها تطبيقات محتملة في التشخيص، والكتابة الفرعية للمرضى، وتطوير المخدرات، بالإضافة إلى العلوم الأساسية.
لتجميع لوحة الأجسام المضادة QMI، يتم وصف البروتوكولات الأولية لفحص الأجسام المضادة واختيارها في القسم 1 أدناه. وبمجرد تحديد ألواح الأجسام المضادة، يتم وصف بروتوكولات لاقتران الأجسام المضادة المختارة للحبات المغناطيسية للملكية الفكرية، وللتحلل الحيوي للأجسام المضادة المسبارية المختارة، في القسم 2. ويرد وصف بروتوكول تشغيل فحص QMI على الخلايا أو الأنسجة lysates في القسم 3. وأخيراً، بما أن تجربة واحدة يمكن أن تولد حوالي 5 x 105 نقاط بيانات فردية، يتم توفير التعليمات ورموز الكمبيوتر للمساعدة في معالجة البيانات وتحليلها والتصور في القسم 4. وترد في الشكل 1نظرة عامة على سير العمل الوارد وصفه في الأبواب من 2 إلى 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتطلب اختبار QMI استثمارات كبيرة في تطوير لوحة الأجسام المضادة والمعدات والكواشف، ولكن بمجرد إنشاء الفحص، يمكن للمرء جمع بيانات عالية الأبعاد لمراقبة شبكات التفاعل البروتينية لأنها تستجيب للرقابة التجريبية المحفزات. من الناحية الفنية، QMI يتطلب الأنابيب الدقيقة وتتبع مواقع العينة والأجس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يرغب المؤلفون في الاعتراف بـ Tessa Davis لمساهماتها الهامة في تطوير تحليل QMI، والأعضاء الحاليين والسابقين في مختبرات سميث وشروم للتوجيه التقني والمدخلات الفكرية. تم تمويل هذا العمل من خلال منح NIMH R01 MH113545 و R00 MH 102244.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
References
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
- Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
- Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
- Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
- Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
- Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
- Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
- Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
- Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science’s STKE. 2007 (389), (2007).
- Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
- Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
- Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
- Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
- Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
- Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).
