Summary

עיבוד העובר, קליפת ביצה, ופטרייתי תרבות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

Published: August 16, 2019
doi:

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי עיבוד מפורטים לדימות דגימות רקמה עדינה באמצעות סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM). שלוש שיטות עיבוד שונות, כלומר, האודיאתיל disilazana (HMDS) ייבוש כימי, ייבוש אוויר פשוט, וייבוש נקודה קריטית מתוארים להכנת קליפות בביצה נוקשה, עוברים בשלבים התפתחותיים מוקדם, ותרבויות פטרייתי בהתאמה.

Abstract

למרות שסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM) משמשת רבות לניתוח במיוחד של דגימות ביולוגיות ולא ביולוגיות שונות, שיטות המעורבות בעיבוד דגימות ביולוגיות שונות כרוכות בשיטות ייחודיות. כל השיטות הקונבנציונליות שתוארו בספרות לעיבוד דגימות עדיין למצוא יישומים שימושיים, אבל שינויים עדינים בהכנה לדוגמה יכול לשנות את איכות התמונה, כמו גם, להציג פריטים. מכאן, באמצעות טכניקה ייחודית הכנה לדוגמה ספציפית לסוג של רקמה מנותח נדרש כדי לקבל תמונה באיכות טובה עם רזולוציה ultraקונסטרוקטיבית. המוקד של מחקר זה הוא לספק את הפרוטוקולים האופטימליים להכנת לדוגמה עבור עוברי הדמיה, קליפות בביצה נוקשה, ו פטרייתי תרבויות באמצעות SEM. המיטובים הבאים היו מומלצים להניב תוצאות טובות עבור שלושת הדגמים הביולוגיים העדינים שנחקרו. שימוש של תיקונים מתון כמו 4% פאראפורמלדהיד או 3% גלוטארלדהיד ואחריו התייבשות עם סדרת אתנול הוא הכרחי. פטרייתי תפטיר על בלוקים אגר שהתקבלו על ידי תרבויות שקופיות תשואות שלמות מבנית טובה יותר בהשוואה לתרבויות נלקח ישירות צלחות אגר. ייבוש כימי של העוברים עם HMDS מספק ייבוש מבלי להציג את המתח משטח המים בהשוואה הנקודה הקריטית ייבוש. HMDS מונע סדיקה הנגרמת על ידי הצטמקות כמו דגימות שבירות פחות במהלך הייבוש. עם זאת, עבור תרבות פטרייתיים, ייבוש נקודה קריטית מספק איכות תמונה מקובלת לעומת ייבוש כימי. קליפות בביצה ניתן לתמונה ללא שלבי הכנה מיוחדים מלבד כביסה יסודית וייבוש האוויר לפני ההרכבה. מתודולוגיות הכנה היו מתוקננת בהתבסס על איכות תמונה מקובלת שהושגו עם כל משפט.

Introduction

סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM) אנליזה מבנית ותוספת הדמיה תאיים מיקרוסקופ אור ליצירת פרופיל תלת מימדי של prokaryotes, צמחים, ובעלי חיים. הרזולוציה המרחבית הגבוהה של ה-SEM הופכת אותו לאחת הטכניקות הרב-תכליתיות ורבת העוצמה ביותר הזמינות לבדיקה של מאפייני מיקרו-מבניים של דגימות בקנה מידה של מיקרומטר. דוגמאות מתייבשות נפתרות בפני מבנים טופוגרפיים ובעלי פרטים אינטנסיביים, המספקים את הבסיס לפיתוח מסקנות חוקיות בנוגע ליחסים פונקציונליים1,2,3 , ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9. כאשר לפרש את התמונות SEM של דגימות ביולוגיות, זה אתגר גדול להבחין בין מבנים מקומיים ואת הפריטים שנוצרו במהלך העיבוד. SEM מופעל בדרך כלל בחללים גבוהים מאוד כדי למנוע כל התערבות של מולקולות גז המשפיעים על הראשי, משני או מפוזרים קורות אלקטרונים הנפלטים מן המדגם10,11. כמו כן, חומרים ביולוגיים רגישים לפגיעה בקרינה בשל המאפיינים הירודים או הלא-מבצעים שלהם. זה חיוני עבור דגימות שנטענו אל SEM להיות יבש לחלוטין וחופשי של כל מזהמים אורגניים כדי לסלק כל החוצה אפשרי בסביבה ואקום גבוהה10,11. כאשר דגימות ביולוגיות מורכבות בעיקר ממים, נדרשים טכניקות מורכבות נוספות כדי להבטיח שמבני הילידים יישמרו.

ההחלטה המתקבלת מבוססת על אופטימיזציה שיטות הכנה ספציפיים סוגי דגימה פרמטרים אינסטרומנטליים מנוצל. לכן, יש צורך להימנע משימוש בשלבי עיבוד כללית לכל סוגי הרקמות. כמה דגימות ביולוגיות ידרוש עיבוד מחמיר פחות כדי לשמר את המבנה שלהם בעוד זמן וטיפול יותר עשוי להיות צורך בסוגים עדינים של דגימות כדי למנוע את המבוא של חפצי ייבוש, כגון הצטמקות והתמוטטות. הכנה לדוגמה היא שלב קריטי בהדמיית SEM; ממצאי מחקרים מורמטרים מושפעים במידה ניכרת מהליכי הכנה לדגימה12,13. שלבי ההכנה המשותפים לדגימות ביולוגיות רבות הן קיבעון, התייבשות וציפוי במתכת כגון זהב, פלטינה או פלדיום כדי להמיר את משטחי הגוף שלהם כדי להיות מוליך לניתוח SEM. האופי והשילוב של השלבים המשמשים ישתנה בהתאם לסוג הרקמה, ולמטרות הספציפיות של המחקר. חיוב הצטברות, רגישות לואקום ולנזק קרן אלקטרוני להוות בעיות בעת עיבוד דגימות ביולוגיות עדין רך, המחייב שלבי עיבוד נוספים כדי לשמור על מבנה מקורי של האובייקט. באמצעות שיטות קונבנציונליות כגון אוסמיום tetroxide תיקון, והתייבשות לגרום הצטמקות ואת התמוטטות של רקמות עדינות14,15,16,17. מטרת המחקר היא להקים מתודולוגיות אלגנטיות הנגזרות משילוב רעיונות ממחקרים קודמים עם שינויים להכנה ותמונה של רקמות עדינות רכות (למשל, עוברי זוחלים, קליפת ביצה של צבים צבועים ותרבויות פטרייתי).

בחירת שיטת תיקון מתאימה היא הצעד החשוב ביותר לניתוח מיקרוסקופי של דגימות ביולוגיות. תיקון הרקמות מיד לאחר בידוד מאורגניזם הוא חיוני כדי למנוע שינוי במבנה שלהם בשל התפרקות. קבע יעילה צריך לסיים תהליכים סלולריים על ידי הסטת התאים במהירות ושמירה על האפקט באופן הפיך כדי לייצב את מבנה המדגם כדי לעמוד בשני שלבי העיבוד הבאים ובדיקה תחת SEM17 , 18. למרות מספר שיטות הקיבעון הכימי והפיזי ידועים, קיבעון כימי הוא נפוץ יותר עבור דגימות ביולוגיות כדי למנוע כל שינוי הסלולר עקב אוטוליזיס, ריקבון, והשפעות ייבוש. קיימות ניסוחים כימיים מרובים קבע שנדונו בספרות17,19,20,21,22,23, תיקונים שפועלים על ידי מדהרפתקאות ו קרו קרוש ביולוגית, ואלה שפותרים על ידי הקרו מקושרת באמצעות החוצה. האלכוהול משמשים לטיפול במיקרוסקופיה ששמרו על מבנה האולטרסאונד בצורה מאוד גרועה ומשמשים בעיקר למיקרוסקופ אור ולא מומלץ לניתוח אלקטרון מיקרוסקופי. הקושרות בין התיקונים האחרים כמו פורמלדהיד, גלוטרלדהיד ואוסמיום tetroxide יוצרים מחתך מולקולרי ומולקולרי בין הקרו בתוך הרקמות, ומספקים שימור מצוין של מבנים אולטרה-מימריים11 ,24,25,26. דגימות ביולוגיות רגישות לטמפרטורה. הטמפרטורה בתחילת קיבעון מומלץ להיות 4 ° צ’ כדי להפחית את הניידות לרוחב של חלבונים ממברנה, כדי להאט את הדיפוזיה של מולקולות התרבות, ולהאט את שיעור הקיבעון11. הזמן הנדרש לתיקון רקמות תלוי במידה רבה בגודל של המדגם ואת המהירות שבה הקיבעון מפזרת ומגיב עם המרכיבים של הדגימה. קיבעון לילה ב 4% פאראפורמלדהיד או 3% גלוטאלדהיד ב-PBS ב-4 ° c היא השיטה המועדפת עבור ניתוח SEM של דגימות המשמשות במחקר זה עבור מאפייני החדירה הרציפה שלהם, אשר מאפשרים דגימות עדינות קטנות יותר לעיבוד17 , מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , 27. צעד לאחר קיבוע עם אוסמיום tetroxide מסולק לא רק בשל טבעו הרעיל אלא גם מצא ליישם שום יתרון נוסף כדי לשפר את איכות התמונה עבור דגימות שנותחו במחקר זה.

דגימות ביולוגיות מכילות נוזלים המפריעים לפעולת SEM; מכאן, הדגימות צריך להתייבש לפני הכנסתו לתא לדוגמה SEM. לאחר התייבשות מובטחת, את הממס יש להסיר מן הרקמה מבלי ליצור ממצאים לתוך הדגימות בשל מתח פני השטח/ייבוש. שלוש שיטות ייבוש שונות היו בשימוש נפוץ במהלך רקמות עיבוד עבור הדמיה SEM: ייבוש האוויר, במצב קריטי ייבוש, ו להקפיא הקפאה דגימות28,29,30,31. מחקרים מעטים מדווחים על שלוש שיטות הייבוש המייצרות תוצאות זהות עם דגימות רקמה בעלי חיים28,29,30,31. תרגול כללי המשמש לדגימות קטנות יותר הן התייבשות כימית על-ידי סדרת הריכוז העולה של אלכוהול ו-הבוחנים (HMDS), אך דגימות גדולות יותר מיובשות באמצעות מכשיר לייבוש בנקודה קריטית (CPD)32. בתהליך הייבוש, כוחות ניכרים הנוצרים בחללים קטנים העוברים דרך הדגימה באמצעות ממשק נוזלי/גז; זה יכול אפילו לגרום לקריסה מלאה של המבנים חלול33. כל דפורמציה המתרחשים בשל הטיפול יכול להיות טועה כתכונה מבנית יליד של הדגימה. לפיכך, התופעה הוכללת לעיבוד יש לסלק ותהליך ייבוש ייחודי צריך להיות מתוקננת עבור כל סוג של רקמה במיוחד כאשר דגימות רקמה עדינה מנותח.

בכמה מבחנים שנערכו באמצעות שילוב שונים של כל התהליכים הנ ל, אנו מתוקננת את השיטות שניתן להשתמש בהן עבור ניתוח SEM של שלוש רקמות עדינות: עוברי זוחלים, קליפות בביצים של צבים צבועים ותרבויות פטרייתי. ביולוגים ומורפוללוגים התפתחותיים מתארים מורפולגנזה נורמלית ובלתי נורמלית במהלך התפתחות העובר בבעלי חוליות מייצגים. חקירות על המסלולים גנטי איתות תלוי בתיאור מורפולוגית של מבנים חדשניים. כדי למנוע כל שינוי פתאומי במבנה העובר בעלי חוליות במהלך ניתוח SEM, אנו ממליצים על ייבוש כימי בעקבות התייבשות. ייבוש כימי באמצעות HMDS היא שיטת הייבוש החדשה יחסית והיתרונות כוללים מהירות יחסית, קלות שימוש, אובדן עלות, ואת המומחיות מוגבלת וציוד צריך9. CPD היא טכניקת ייבוש בשימוש נפוץ באמצעות passaging CO2 על פני הדגימות בטמפרטורה מסוימת ולחץ. זיהינו כי HMDS מתאים לייבוש רקמות עדינות רכות ומאפשר דגימות גדולות יותר להיות מעובד בהשוואה נקודה קריטית ייבוש, אשר גרם דפורמציה נרחבת רקמות עובריים. מספר שיטות שימשו כדי להכין דגימות עבור הדמיה SEM כדי ללמוד את המאפיינים מורפולוגיים של פטריות34. דגימות פטרייתי הם בדרך כלל קבוע ב אוסמיום tetroxide ואחריו התייבשות אתנול ובנקודה קריטית ייבוש, אשר עשוי לספק תוצאות משביעות רצון, למרות ההשפעות הרעילות של אוסמיום tetroxide6,7,35 ולאבד חומרים פטרייתיים תוך שינוי פתרונות במהלך העיבוד מבטאים חסרונות. טכניקת ההכנה לדוגמה באמצעות ייבוש האוויר ללא קיבעון היתה גם התאמן36 אבל התוצאות של מבנים צומק ו התמוטט, ותצפית של דגימות כאלה יכול בקלות להיות מפורש בזמן אפיון המינים. Hypha פטרייתי מאבד את שלמות במגע עם נוזלים ואף ייבוש לא ניתן להשיג כדי לשחזר את המבנה. בשל השפעה זו, ייבוש ההקפאה משמש בדרך כלל לייבוש רקמות רכות כמו פטריות מיצליום. ייבוש ההקפאה עובד היטב חומרים נקיים, אבל הנוכחות של מלחים או הפרשה יהיה לטשטש פרטי השטח כי יזוהו רק בשלב הצפייה SEM. אנו מצמידים את שיטת תרבות השקופיות עם תיקון glutarאלדהיד ואת הנקודה הקריטית ייבוש כדי להניב פרטים מבניים של מיקוף פטרייתי שלמים ונבגים. למרות CPD ייבוש הצטמקות העוברים, זה הביא גם מבנים mycelial היטב כאשר ביחד עם קיבעון גלוטרלדהיד. קליפת המעטפת היא בעלת חשיבות עיקרית לעובר בעלי חיים בלתי-מכניים על-ידי הפעלת כיסוי הגנתי, אלא גם מתן יציבות מכנית, חדירות לגז ומים, ושמורת סידן לעובר המתפתח. כדורי הביצה של צב המים המתוקים מסווגים כ”קשיחים” המבוססים על המבנה שלהם, ובגלל זמינותם קיבלו תשומת לב משמעותית מהביולוגים1,2,3,4 , מיכל 5 , מיכל בן 6 , מיכל סבן , 37 , 38.

אנו לפרט שיטות פשוטות לבדיקה קלה של קרום קליפת הקליפה של צב צבוע שניתן להחיל על כל מיני ביצה נוקשה. מתודולוגיות הכנה הוערכו על בסיס איכות התמונה וכתוצאה מכך מופחתת חפצים פוטנציאליים.

Protocol

הערה: הצב הצבוע (כריסמייס פיקטה) ביצים המשמשות במחקר זה נאספו במהלך עונת הקינון של מאי עד יוני 2015-16 מתחנת השדה של רייס קריק, oswego ניו יורק עם אישור המתקבל מהמחלקה הממלכתית של ניו יורק לסביבה שימור (DEC). 1. שיטת ייבוש כימית לעיבוד עוברים עבור SEM לאסוף ביצי צב מאתרי שדה במ?…

Representative Results

איור 1 הצג סריקת מיקרוגרפיה אלקטרונית של צב צבוע (כריסמייס picta) עוברים. ביצי צב צבוע שנאספו ומודחים על מצעים בינונית, רכוב על האלומיניום לאחר ייבוש כימיים שימשו הדמיה SEM (איור 1א-ה). מבט לרוחב של העובר שלב 12 מראה את מבנים הגולגולת; הגדולה הלסת התחת…

Discussion

בחדר העבודה שלנו, סוכני קיבעון שונים, התייבשות ושיטות ייבוש נבדקו כדי להכין שלוש דגימות ביולוגיות עדין שונות עבור הדמיה SEM: עוברים, קליפות בביצה, ופטריות בתרבויות. SEM משמש בדרך כלל עבור ניתוח פני השטח, כך חדירה מתוקנת היא פחות בנוגע, אבל זה חייב להיות מובן כי מבנים פנימיים קבוע לקוי יגרום כיו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לד ר דניאל בbaldassarre, SUNY Oswego לדיונים מועילים והערות על כתב היד. מחקר זה היה נתמך על ידי רייס קריק מענקי שותף, Oswego; האתגר מענקים SUNY Oswego הקרן הלאומית למדע (NSF) מענקים קטנים PGL ו-JG.

Materials

Agar Fischer Scientific S25127A for slide cultures
Aluminum pin stub Tedpella 16111 12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar BD 213400 DF0013-17-6 Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol Fischer BioReagents BP904-100 Antibiotic for media
Coarse Vermiculite Greenhouse Megastore SO-VER-12 bedding medium
Clear 12- well plate Corning 07-201-589 for fixing embryo
Coverslips Fischer Scientific S17525B for slide culture
Critical Point Dryer Quorum CPD EMS850 critical point drying
Culture dishes Fischer Scientific 08 747B DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol Fischer Scientific A406P 4 dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers Tedpella 5804 style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde Fischer Scientific G151-1 fixative
Gold target for sputter coater DENTON VACUUM TAR001-0158 Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana Fischer Scientific C19479-5000 chemical drying agent
Kim wipes Kimtech S-8115 cleaning
Microscope slides Thermo Scientific 67-762-16 for slide culture
Microscopy Scissors Tedpella 1327 Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors Tedpella 1346 Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon Fine Science Tools 10370-17 Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts Corning 0330B09 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde Fischer Scientific T353 500 fixative
Peat moss Walmart- Miracle Gro 551705263 bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape Tedpella 5000 12 mm OD
Sputter coater DENTON VACUUM DESK V thin metal coating
SEM JEOL USA JEOL JSM 6610LV scanning electron scope electron microscopy

References

  1. Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
  2. Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
  3. Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
  4. Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
  5. Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
  6. Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
  7. Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
  8. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  9. Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
  10. Echlin, P. . Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
  11. Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
  12. Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
  13. Baker, J. R. . Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , (1958).
  14. Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
  15. Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , 13-105 (1970).
  16. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
  17. Hayat, M. A. . Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , (2000).
  18. Hayat, M. A. . Fixation for electron microscopy. , (1981).
  19. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  20. McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
  21. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  22. Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
  23. Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
  24. Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
  25. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  26. Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
  27. Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
  28. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  29. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
  30. Barre, C., O’Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
  31. Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
  32. Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
  33. Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
  34. Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
  35. Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
  36. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
  37. Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
  38. Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
  39. Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
  40. Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
  41. Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
  42. Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
  43. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
  44. Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate “Gymnodinioid” Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
  45. Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
  46. Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
  47. Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
  48. Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
  49. Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, (1990).
  50. Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
  51. Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
  52. Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).

Play Video

Cite This Article
Gibbons, J., Geetha-Loganathan, P. Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (150), e60018, doi:10.3791/60018 (2019).

View Video