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生物化学

대장균의 이종 식에 의한 멤브레인 수송기의 특성화 및 멤브레인 소포 생산

Published: December 31, 2019
doi:
10.3791/60009
, ,
1Department of Biological Sciences,Bowling Green State University

Summary

우리는 프랑스 프레스를 사용하여 대장균 및 세포의 용해에서 이종 발현에 의해 생성된 막 소포 제제에서 양성자 구동 막 수송기의 특성화 방법을 설명합니다.

Abstract

새로운 멤브레인 수송기를 기능적으로 특성화하기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 폴리 아민은 모든 유기체에서 유비쿼터스이지만 식물의 폴리 아민 교환기는 확인되지 않았습니다. 여기서, 우리는 대장균 세포의 용해로부터 생성된 막 소포를 이용하여 폴리아민 항균제를 이종적으로 발현하는 식물 항균제를 특성화하는 방법을 간략하게 설명한다. 첫째, 우리는 이질적으로 폴리아민 및 아르기닌 교환 수송기결핍된 대장균 균주에서 AtBAT1을 표현하였다. 소포는 프랑스 프레스를 사용하여 제조되었고, 초원심분리에 의해 정제되고, 수송기의 기질 특이성을 입증하기 위해 표지된 기판의 멤브레인 여과 분석에서 활용하였다. 이 검역은 AtBAT1이 아르기닌, γ-아미노부티르산(GABA), 푸레신 및 스페르미딘의 양성자 매개 수송기임을 입증했습니다. AtBAT1의 분석을 위해 개발된 돌연변이 균주는 식물 및 동물 폴리아민 교환기의 다른 패밀리의 기능 분석에 유용할 수 있다. 우리는 또한 이 단백질이 세균성 세포막에서 표현될 수 있는 한, 이 접근이 antiporters의 많은 그밖 모형을 특성화하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 가설합니다. 대장균은 토착 수송기를 돌연변이시키는 데 사용할 수 있는 여러 가지 방법이 있기 때문에 새로운 운송업자의 특성화에 좋은 시스템입니다.

Introduction

대사 산물의 인신 매매에 관여하는 단백질은 생리적 조절의 필수적인 수준을 구성하지만, 식물 막 수송자의 대부분은 아직 기능적으로 특성화되지 않았습니다. 새로운 수송 단백질을 특성화하기 위해 몇 가지 전략이 구현되었습니다. 대장균 및 효모, 제노푸스 난소, 포유류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포와 같은 모델 유기체에서의 이종 발현은 모두 그들의 수송 활성을 결정하는 데 사용되어 왔다1. 진핵 세포는 진핵 단백질의 발현을 위해 선호되는데, 왜냐하면 기본 세포 조성, 신호 변환 경로, 전사 및 번역 기계는 기본 조건과 호환되기 때문이다.

효모는 식물에서 새로운 수송 단백질의 특성화를 위한 중요한 모델 유기체였습니다. 효모(Saccharomyces pombe)에서성공적으로 발현된 최초의 식물 수송 단백질은 클로렐라2에서헥소스 수송기 HUP1이었다. 그 이후, 많은 식물 수송 단백질은 효모 발현 시스템을 사용하여 기능적으로 특징지어졌다. 여기에는 식물 성 당 수송기 (SUC1 및 SUC23,VfSUT1 및 VfSTP14)및 보조 수송기 (AUX1 및 PIN5)가포함됩니다. 효모를 식물 성 단백질을 발현하기 위해 활용하는 단점은 효모가 이 소기관이 부족하기 때문에 석고 국소화 단백질의 활성이 손상될 수 있으며, 잘못접힌응집체의 형성 및 막 단백질의 과발현으로 인한 효모의 응집력 의 활성화7,8,9.

제노푸스 난모세포에서 의 수송 단백질의 이종발현은수송기(10)의전기생리학적 특성화에 널리 사용되어 왔다. 제노푸스 난소에서 이종발현을 이용한 제1 식물 수송 단백질은 애기장대 칼륨 채널 KAT110 및 애기장대 헥소스 수송기 STP111이었다. 그 이후, 제노푸스 난모세포는 혈장막 수송기12,공병수크로오스 수송기 SUT413 및 백공말레이 수송기 ALMT914와같은 많은 식물 수송 단백질을 특성화하기 위해 사용되어 왔다. 수송 측정을 위한 제노푸스 난모세포의 중요한 제한은 세포내 대사산물의 농도가 조작될 수 없다는 것입니다1. 더욱이, 제노푸스 난모세포를 준비하기 위해서는 전문적인 지식이 필요하며, 난모세포 배치의 가변성은 제어하기 어렵다.

모델 유기체 인 대장균에서의 이종 발현은 새로운 식물 수송 단백질의 특성화 측면에서 이상적인 시스템입니다. 완전히 서열화된 게놈15를사용하면 대장균의 분자 및 생리학적 특성이 잘 알려져 있다. 분자 도구와 기술은 잘 설립16. 또한, 상이한 발현 벡터, 비병원성 균주 및 돌연변이체는17,18,19. 또한, 대장균은 높은 성장속도를 가지고 있으며 실험실 조건하에서 쉽게 재배할 수 있습니다. 많은 단백질은 대장균9에서다량으로 쉽게 발현 및 정제될 수 있다. 세포 시스템에서 단백질을 직접 분석할 수 없을 때, 단백질을 리포솜으로 재구성하는 것은 또한 성공적이었습니다, 정제된 막 단백질의 특성화를 위한 도전적인 혁신이기는 하지만. 대두, 옥수수, 쌀 및 애기장대의 인산수송기, 디카르복실레이트-트리카르복실레이트 캐리어 등의 용질 수송기를 포함하는 식물 미토콘드리아 수송 단백질의 기능적 특성은 이 모델 시스템20,21을사용하여 달성되었다. 그러나, 토마토 단백질 SICAT9의 재조합 단백질은 재구성 실험에서 비기능성 인 것으로 나타났으며, CAT 수송기 패밀리의 다른 구성원은 제노푸스 난모세포 검소22에서비기능성인 것으로 나타났다. 따라서 멤브레인 수송기의 특성화를 위해 추가적인 분자 도구가 필요합니다.

5 개의 폴리 아민 수송 시스템은 대장균23에서발견된다. 그들은 정자와 퍼트린의 섭취를 중재 두 ABC 수송을 포함, 퍼트린 / 오르니틴 교환기, 시체 / 리신 교환기, 정자 수출 및 퍼트린 수입. 상기 푸트르신 교환기 PotE는 원래 소포 분석을 사용하여 특징지어졌으며, 여기서 내부 소포는 프랑스 프레스로 세포를 포하하고 오르니틴24에대한 대가로 소포내로 방사성 발염된 푸트르신의 섭취를 측정함으로써 제조되었다. 소포 분석또한 양성자 구배25에응하여 칼슘의 수송을 중재한 칼슘 수송기를 특성화하기 위하여 이용되었습니다. 이 실험은 우리가 다른 폴리 아민 교환기의 특성화를위한 전략을 개발하도록 자극했다. 우리는 먼저 PotE 및 CadB 교환기에서 대장균 결핍의 변형을 만들었습니다. 여기서, 우리는 변형된 대장균 균주에서 이질적인 발현에 의한 식물 폴리아민 항균제의 기능적 특성화, 프랑스 프레스를 이용한 막 소포의 생성, 및 방사성 표지된 세포사이다.

Protocol

1. P1 전이로 돌연변이를 두 배로 노크하는 대장균의 생성 대장균 단일 녹아웃 돌연변이 균주 인 대장균 유전 스톡 센터(http://cgsc.biology.yale.edu)로부터 ΔPotE 및 ΔCadB를 획득합니다.참고: ΔPotE 균주는 카나마이신 내성26이고 ΔCadB 균주는 테트라사이클린 내성<sup class="xr…

Representative Results

이 프로토콜의 주요 단계는 그림 1에그림으로 요약되어 있습니다. 간략하게, 대장균 세포는 모든 폴리아민 교환기에서 결핍되고 AtBAT1을 발현하여 배양되고, 원심분리되고, 완충액으로 세척하고, 프랑스 프레스를 사용하여 세포 용해를 행하였다. 용해는 주로 내부 아웃소포를 생성하고 세포 외부의 버퍼를 트랩하는 경향이있다. 세포 파…

Discussion

본 연구에서, 우리는 먼저 대장균에서 단백질을 발현한 다음 막 소포를 생성하여 항균제의 특성화를 위한 방법을 개략적으로 설명하여 이종발 단백질을 무세포 시스템에서 분석할 수 있도록 한다. 대부분의 분자 생물학 실험실에서 발견되는 장비 이외에, 이 전략은 프랑스 언론, 초원심분리기 및 방사성 동위 원소 검소를 실시하는 시설에 대한 액세스를 필요로합니다.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 프로젝트에 대한 지원은 BGSU 대학원, 후원 프로그램 및 연구의 BGSU 사무실에서 왔다.

Materials

2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3H-putrescine PerkinElmer NET185001MC
3H-spermidine PerkinElmer NET522001MC
4-chloro-1-naphthol Sigma-Aldrich C8890
14C arginine Moravek Inc. MC137
Arginine Sigma-Aldrich A-5006
Anti-His (C-term)-HRP antibody ThermoFisher R931-25 Detects the C-terminal polyhistidine (6xHis) tag, requires the free carboxyl
group for detection
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
BCA protein assay kit ThermoFisher 23227 Pierce BCA protein asay kit.
Bromophenol blue Bio-Rad 161-0404
Carboxypeptidase B Sigma-Aldrich C9584-1mg
Centrifuge Sorvall SS-34 fixed angle rotor and GA-6 fixed angle rotor
Dounce tissue grinder LabGenome 7777-7 Corning 7777-7 pyrex homogenizer with pour spout.
Ecoscint-H National Diagnostics LS275 scintillation cocktail
EDTA Sigma-Aldrich
Filtration manifold Hoefer FH225V
French Pressure Cell Glen Mills FA-080A120
GABA Sigma-Aldrich A2129
Glutamate Sigma-Aldrich G6904
Glycerol
GraphPad Prism software http://www.graphpad.com/prism/Prism.htm
Hydrogen peroxide KROGER
Potassium Chloride J.T. Baker 3040-01
Liquid scintillation counter Beckman LS-6500
Maleate Sigma-Aldrich M0375
Nanodrop ThermoFisher
Nitrocellulose membrane filters Merck Millipore hawp02500 0.45 µM
PCR clean up kit Genscript QuickClean II
Potassium Phosphate dibasic ThermoFisher P290-500
putrescine fluka 32810
Potassium Phosphate monobasic J.T.Baker 4008
Spermidine Sigma-aldrich S2501
Strains :E. coli ΔpotE740(del)::kan, ΔcadB2231::Tn10 This manuscript Available upon request. Strain is deficient in the PotE and CadB polyamine exchangers.
Tris-base Research Products T60040-1000
Ultracentrifuge Sorvall MTX 150 46960 Thermo Fisher S150-AT fixed angle rotor
Ultracentrifuge tubes ThermoFisher 45237 Centrifuge tubes for S150-AT rotor
Vector: pBAD-DEST49 ThermoFisher Gateway expression vector for E. coli
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References

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Ariyaratne, M., Ge, L., Morris, P. F. Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles. J. Vis. Exp. (154), e60009, doi:10.3791/60009 (2019).
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