Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi
Summary
Bu makalede, in vitro ve in vivo kullanılmak üzere fonksiyonel T hücrelerinin yüksek sayıda verim amacı ile, antijene özgü CD8 T hücrelerinin üretimi ve bunların in vitro genişlemesi için bir protokol açıklanmaktadır.
Abstract
Tip 1 Diyabet (T1D) beta hücre yıkımı ve insülin üretiminin mutlak kaybına yol açan adacık spesifik otoimmünite ile karakterizedir. Spontan obez olmayan diyabet (NOD) fare modelinde, insülin birincil hedeftir ve tek bir anahtar insülin epitop kaldırmak için bu hayvanların genetik manipülasyon hastalığı önler. Bu nedenle, bu patojenik epitop taşıyan profesyonel antijen sunan hücrelerin seçici ortadan kaldırılması (AKO’lar) istenmeyen insülin spesifik otoimmün yanıtları inhibe etmek için bir yaklaşımdır, ve büyük olasılıkla daha büyük çeviri potansiyeline sahiptir.
Şimerik antijen reseptörleri (CAR) seçici hastalık neden antijenleri hedef T hücreleri yönlendirebilirsiniz. Bu teknik, birden fazla kanser tedavisinde benimseyen hücre tedavisi için hücresel mühendislik kullanmak için son girişimleri için temeldir. Bu protokolde, düşük sayıda naif hücreden başlayarak yüksek sayıda fonksiyonel antijene özgü CD8 CAR-T hücresi üreten optimize edilmiş bir T-hücre retrovirüsü (RV) transdüksiyonu ve in vitro genleşme protokolünü açıklıyoruz. Daha önce birden fazla CAR-T hücre protokolü tanımlanmıştır, ancak genellikle transdüksiyon sonrası nispeten düşük transdüksiyon verimliliği ve hücre canlılığı ile. Buna karşılık, protokolümüz %90’a kadar transdüksiyon verimliliği sağlar ve üretilen hücreler iki haftadan fazla invivo hayatta kalabilir ve tek bir infüzyon dan sonra hastalığı önemli ölçüde geciktirebilir. Kritik adımların kolayca izleilebilmeleri için hücre bakım ve transdüksiyon protokolünün ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Birincil hücre yalıtımından CAR ifadesine kadar tüm işlem 14 gün içinde gerçekleştirilebilir. Genel yöntem, hedefin bilindiği herhangi bir fare hastalığı modeline uygulanabilir. Benzer şekilde, spesifik uygulama (patojenik peptid/MHC sınıf II kompleksini hedeflemek) önemli bir kompleksin tanımlandığı diğer otoimmün hastalık modelleri için de geçerlidir.
Introduction
İstenmeyen hedef dışı etkilerin olası azaltılmış risk göz önüne alındığında, antijene özgü immün tedaviler (ASI) T1D gibi otoimmün hastalıklar için umut verici tedaviler vardır. Kanıt birikmesi( prepro)insülin immün yanıtların T1D 1’de özellikle önemli olabileceğini düşündürmektedir. Son on yılda, bizimki de dahil olmak üzere birden fazla gruptan yapılan çalışmalar, belirli MHC sınıf II molekülleri (B:9-23/MHCII) tarafından 9 ila 23 arasında insülin B zinciri amino asitleriçeren bir epitopun sunumunun T1D’nin gelişiminde önemli bir rol oynadığını kuvvetle göstermektedir. fareler ve insanlar2,3,4,5. Seçici B:9-23/MHCII kompleksi hedef için, biz bir monoklonal antikor üretti, mAb287 adlı, hormon insülin veya kompleksleri diğer peptidler içeren çapraz reaktivite vardır6. MAb287 bloklar antijen sunum in vitro, ve pre-diyabetik NOD fareler için mAb287 haftalık uygulama tedavi farelerin% 35 T1D gelişimini geciktirdi6. In vivo antijen sunumengellemek için, sık enjeksiyonları genellikle yüksek sirkülasyon konsantrasyonu korumak için gereklidir. Biz t hücreleri yeniden programlamak için Ab287 yüksek özgüllük yararlanarak bu zorluğun üstesinden gelebilir hipotez, böylece T1D için geliştirilmiş bir antijen-spesifik T hücre tedavisi sağlayan7.
Sitotoksik T hücrelerinin biliş likörlerinin tek bir kopyası bile8,9,10olarak ifade edilirse hedeflerini öldürebildiği bildirilir. Böylece, B:9-23/MHCII spesifik CD8 T hücrelerinin, etkisini uygulamak için aynı APC’de birden fazla komplekse bağlanması gereken ana antikordan daha istenmeyen antijen sunumunu ortadan kaldırmada daha yüksek verimliliğe sahip olması beklenmektedir. CAR T hücreleri birden fazla insan kanseri tedavisinde kullanılmıştır11,12,13, ve aynı zamanda otoimmünite etkili olabilir14. Ancak, patojenik peptid-MHC kompleksleri için özgüllüğü olan CAR-T hücreleri şimdiye kadar T1D ilerlemesini değiştirmek için kullanılmamıştır. Aşağıda açıklanan en iyi şekilde optimize edilmiş CD8 T hücre transdüksiyon tekniğini kullanarak, son zamanlarda bunun gerçekten uygulanabilir bir yaklaşımı temsil ettiğini nispatinin kanıtını gösterdik7.
Bu protokolde, verimli ve modern bir transdüksiyon ve genişletme yöntemini özetliyoruz. Protokolümüz yüksek verimlilikte fare CD8 CAR T hücrelerinin oluşumunu gerektiren diğer çalışmalar için geçerlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol retroviral transdüksiyon ile antijene özgü CD8 CAR-T hücreleri üretmek için etkili bir yöntem açıklar. Protokolümüzün transdüksiyon verimliliği genellikle yüksektir ve CAR’ın sağlam ifadesi genellikle gözlenir. Genişletilmiş CAR T hücreleri üst-aktive T hücrelerinin temel özelliklerini korumak, ve antikor özgüllüğü, ve in vitro ve in vivo kullanım için hem uygundur. Biz NOD farelerde Tip 1 Diyabet yeniden programlanmasında Ab-CAR CD8 T hücreleri uyguladık7</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma JDRF 1-INO-2015-74-S-B, 2-SRA-2016-238-S-B ve SRA-2-S-2018-648-S-B, Diyabet Eğitim ve Eylem Ödülü ve Baylor College of Medicine’de Moleküler Tıp Araştırma Caroline Wiess Hukuk Fonu tarafından desteklenmiştir. Hücre sıralama nih (S10RR024574 ve P30CA125123) finansmanı ile Baylor Tıp Koleji’nde Sitometri ve Hücre Sıralama Çekirdek tarafından desteklendi. Tüm peptid-MHC tetramerleri NIH Tetramer Çekirdek Tesisi’nden elde edilmiştir.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50mM) | Gibco | 21985-023 | 50 uM |
| 5’ RACE PCR | Clontech | 634859 | |
| anti-mouse CD28 antibodies | eBioscience | 14-0281-86 | final concentration at 1µg/ml |
| anti-mouse CD3e antibody | eBioscience | 145-2C11 | final concentration at 1µg/ml |
| Biotin Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 554410 | Working concentration at 0.5 µg/ml |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Endo-free Maxi-Prep kit | Qiagen | 12362 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | Final 50 µg/ml. |
| Heat inactivated FCS | Hyclone | SH30087.03 | Final 10% FCS |
| HEPES (100X) | Gibco | 15630-080 | 1X |
| IAg7-CLIP tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| IAg7-insulin P8E tetramer-BV421 | NIH tetramer Facility at Emory | per approval | Working concentration at 6 µg/ml |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS 100x) | ThermoFisher | 51500056 | Final concentraion is 1x |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Separation Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miletenyi Biotec Inc | 130-104-075 | |
| Mouse CD8a+ T Cell Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | |
| Opti-MEM medium | ThermoFisher | 31985070 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000U/ml) | ThermoFisher | 15070063 | 50 U/ml |
| Phoenix-ECO cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| pMIG II | Addgene | 52107 | |
| pMSCV-IRES-GFP II | Addgene | 52107 | |
| Purified Rat Anti-Mouse IFN-γ | BD Biosciences | 551216 | Working concentration at 3 µg/ml |
| Red cell lysis buffer | Sigma | R7767 | |
| RetroNectin | Takara | T100A | Working concentration at 50 µg/ml in PBS |
| rhIL-2 (stock concentration 105 IU/ul) | Peprotech | 200-02 | Final concentration at 200 IU/ml |
| rmIL-7 ( stock concentration 50ng/ul) | R&D | 407-ML-005 | Final concentration at 0.5ng/ml |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Tryple | Gibco | 12605-028 |
References
- Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 Diabetes. Lancet. 383, 69-82 (2014).
- Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality. Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).
- Nakayama, M., et al. Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice. Nature. 435, 220-223 (2005).
- Crawford, F., et al. Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).
- Stadinski, B. D., et al. Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).
- Zhang, L., et al. Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).
- Zhang, L., et al. Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).
- Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse. Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews. Immunology. 3, 973-983 (2003).
- Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. Direct observation of ligand recognition by T cells. Nature. 419, 845-849 (2002).
- Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. Chimeric antigen receptor therapy for cancer. Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).
- Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells. Blood. 116, 3875-3886 (2010).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).
- Fishman, S., et al. Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes. Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).
- Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).
- Johnstone, A., Thorpe, R. . Immunochemistry in practice. , (1996).
- Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. . Lymphocytes: a practical approach. , (2000).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).
- Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons. Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).
- Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse. PLoS One. 8 (3), e59701 (2013).
- Jansen, A., et al. Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice. Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).
- Corbett, A. J., et al. T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways. Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).
- Griffith, I. J., et al. Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).
- Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).
- Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection. Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).
