L'enrichissement et la détection des toxines de Clostridium perfringens dans les échantillons d'aliments au détail

REMARQUE : C. perfringens est considéré comme un organisme de niveau 2 (BSL2) de danger pour la biosécurité. Bien que tous les échantillons d’aliments ne contiennent pas de C. perfringens,tous les échantillons cultivés doivent être traités comme tels. Toutes les précautions appropriées et l’équipement de protection du personnel (EPI) doivent être portés en tout temps. Décontaminer tous les matériaux avant l’élimination. 1. Préparer RPM modifié4,15 Combinez 30 g/L de thioglycolate moyen, 60 g/L de gélatine, 5 g/L de peptone, 5 g/L de glucose, 5 g/L de phosphate de potassium dibasic, 3 g/L extrait de levure, 1,5 g/L de chlorure de sodium, 0,5 g/L de sulfate ferreux dans l’eau deionized jusqu’à ce qu’elle soit dispersée uniformément. Nous fabriquons généralement 1 lots L. Autoclave à 121 oC pendant 15 min. Laisser refroidir jusqu’à environ 40 oC. Une fois que le RPM est frais, ajouter la D-cycloserine à une concentration finale de 440 mg/L.REMARQUE : Les concentrations de D-cycloserine dissoutes dans l’eau stérile à 50 mg/mL peuvent être stockées à -20 oC pour une utilisation future. Transférer aseptiquement 10 ml de Tr/min à 15 ml de tubes coniques. La tr/mIN peut être préparée en lots et stockée à 4 oC pendant une année pouvant aller jusqu’à un mois. Réchauffer la RPM à 37 oC avant l’utilisation. 2. Collecte d’échantillons et incubation de La RPM Transportez les aliments au laboratoire à des températures ambiantes dans un délai de 1 h. Les aliments peuvent être transportés dans des emballages d’origine ou des contenants stériles. Si ce n’est pas un test immédiat, les aliments peuvent être entreposés à -20 oC jusqu’à l’utilisation. Prenez note du type d’aliments et du pays d’origine selon l’étiquette d’emballage, le cas échéant, ainsi que de toute autre information pertinente. Retirer environ 1,0 à 2,0 g de nourriture et le transférer dans un plat stérile Petri ou équivalent. Hacher finement avec une lame de rasoir stérile ou un scalpel. Inoculer dans 10 ml de phosphate tamponné saline (PBS) dans un tube conique de 15 ml. Bien mélanger. Pour sélectionner les cellules végétatives, transférer 5 ml du mélange PBS-alimentaire dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de RPM. Fixez le couvercle hermétiquement. Pour sélectionner les spores, chauffer les 5 ml restants de mélange PBS-alimentaire à 85 oC pendant 15 min, puis transférer dans un tube conique de 15 ml contenant 10 ml de Tr/min. Fixez le couvercle hermétiquement. Vortex et inverser les cultures food-RPM pour assurer un mélange complet. Scellez fermement les tubes coniques et enveloppez les couvercles avec du film de paraffine ou une pellicule plastique pour assurer un environnement anaérobie. Incuber la nuit (ON) à 37 oC. Le lendemain matin, notez toute turbidité ou fermentation dans les tubes RPM. 3. TSC “sandwich” placage Inoculer les cultures ON RPM dans l’agar TSC à l’aide d’une technique de « sandwich » (figure 2) décrite ci-dessous. Préparer la gélose TSC selon les instructions du fabricant. Préparer la couche de base des plaques TSC en transférant 10 ml d’agar TSC fondu à la vaisselle stérile Petri et permettre de se solidifier. Ceux-ci peuvent être préparés à l’avance et stockés à 4 oC. Assurez-vous que les assiettes sont réchauffées à température ambiante avant de les utiliser. Pour la couche supérieure de la plaque TSC, maintenez le reste de la gélose TSC fondue à 40 oC.REMARQUE : Bien que le point de fusion de l’agar soit supérieur à 85 oC, l’agar fondu se solidifie autour de 32 à 45 oC. Récupérez soigneusement les cultures ON RPM et transférez 100 L à la base d’agar de TSC. En raison de la fermentation, certaines cultures peuvent être sous pression. Assurez-vous de porter tous les EPI appropriés. Étendre l’inoculum RPM à l’aide de perles de verre stérilisées ou d’épandeurs cellulaires. Laisser le RPM être « absorbé » dans l’agar TSC pendant 5 à 10 min à température ambiante. Transférer délicatement 20 ml d’agar TSC fondu de 40 oC sur une plaque à l’aide d’une pipette sérologique. Remplacer le couvercle du couvercle de la vaisselle Petri et permettre à l’agar TSC de se solidifier complètement à température ambiante. Inverser le plat Petri et incuber à 37 oC ON. Si des dilutions en série sont souhaitées, effectuer des dilutions des cultures ON RPM en RPM frais et préréchauffé s’est réchaud avant d’être inoculation dans l’agar de TSC. 4. Sous-creusation des colonies de sulfite-réduction Le lendemain matin, retirer les plaques de l’incubateur et examiner la croissance bactérienne. Des bactéries aérobiques peuvent être présentes à la surface de l’agar. Des bactéries anaérobies se trouveront de plus en plus encastrées dans l’agar. Les bactéries sulfite-réductrices tourneront le noir d’agar environnant. Les colonies possibles de C. perfringens seront noires et incorporées dans l’agar. C. perfringens colonies suspectées seront positifs pour la réduction de sulfite et apparaîtra noir, incorporé dans l’agar. À l’aide d’un eyedropper stérile à usage unique, « arracher » les colonies noires de l’agar et transférer à 10 ml de RPM frais dans un tube conique de 15 ml. Il est important que l’air du eyedropper soit expulsé avant de percer l’agar. S’il y a une quantité dense de croissance bactérienne aérobie à la surface de la plaque, utilisez un grattoir à cellules stériles pour enlever les colonies des zones sélectionnées. Plusieurs C. perfringens colonies suspectées peuvent être échantillonnés à partir de la même plaque TSC dans des cultures rPM distinctes. Fixez les couvercles coniques et enveloppez-les dans un film de paraffine ou une pellicule plastique. Incuber ON à 37 oC. 5. Extraction d’ADN Enlever les cultures ON RPM et examiner les signes de croissance, y compris la turbidité et la fermentation. Invertissez délicatement la culture de la RPM pour disperser les bactéries sédentaires et ouvrir soigneusement. Transférer 1 ml de la culture dans un tube de microcentrifuge. Centrifugeuse à la vitesse maximale (environ 15 000 x g)pendant 10 min pour granuler les bactéries. Laver les granulés avec 1 ml de PBS stérile. Dans certaines circonstances, la gélatine non digérée s’installera au-dessus des bactéries granulées. Pour enlever la gélatine, “fluff” hors gélatine en agitant doucement avec PBS à l’aide d’une micropipette. Cela va “fluff-up” la gélatine tout en laissant la pastille bactérienne intacte. Retirez le mélange PBS-gélatine avec une aspiration douce. Suspendre à nouveau le reste des granulés bactériens avec 1 ml de PBS frais. Centrifuger la pastille bactérienne en suspension à la vitesse de pointe pendant 10 min et aspirer soigneusement le supernatant. Effectuer immédiatement l’extraction de l’ADN à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN et d’un protocole spécialement créé pour l’extraction de l’ADN à partir de bactéries Gram-positives (voir le Tableau des matériaux). Utilisez immédiatement l’ADN extrait ou entreposez-les à -20 oC jusqu’à ce que l’analyse PCR. 6. Détection de C. perfringens via le génotypage PCR Pour déterminer si les cultures sont positives pour les toxinotypes de C. perfringens, examinez l’ADN extrait pour différents gènes de toxine par l’intermédiaire de PCR.REMARQUE: Parce que nous sommes les plus intéressés par la toxine epsilon produisant des souches de type B et D C. perfringens, nous évaluons pour la présence des gènes de la toxine alpha, bêta, et epsilon. Les amorces sont énumérées dans le tableau 2. Les amorces pour l’ADN ribosomal de 16s sont employées comme contrôle d’extraction d’ADN. Des amorces supplémentaires peuvent être utilisées pour tester les toxinotypes A à G et peuvent être trouvées dans la littérature publiée2,12,13. Utilisez l’ADN précédemment extrait de C. perfringens comme un contrôle positif. Ce contrôle garantit que tous les composants des réactions PCR fonctionnent. Nous utilisons l’ADN extrait de C. perfringens type B (ATCC 3626) comme notre contrôle positif. Cultivez ATCC 3636 ON en RPM à 37 oC et extrayez l’ADN en utilisant les mêmes méthodes décrites dans les étapes 5.1-5.7. Conserver l’ADN extrait à -20 oC jusqu’à l’utilisation. Définir les conditions de PCR comme suit : 94,0 oC pendant 3 min; 94,0 oC pour 30 s; 47,9 oC pour 30 s, 72,0 oC pour 1 min (Répéter les étapes 2 à 4 pour 35 cycles); 72,0 oC pendant 10 min. Pour confirmer les produits PCR, exécutez des réactions de PCR sur un gel d’agarose de 1,8 g/100 ml utilisant des techniques standard. La taille prévue des produits PCR est indiquée dans le tableau 2. Les résultats PCR typiques sont affichés dans la figure 3.