Summary

Оценка состояния оплодотворения путем отслеживания ядерной морфологии спермы в арабидопсис двойное оплодотворение

Published: August 29, 2019
doi:

Summary

Мы демонстрируем метод определения успешного или неудачного оплодотворения на основе сперматозоиды ядерной морфологии в арабидопсисдвойном двойном оплодотворении с помощью эпифлюоресцентного микроскопа.

Abstract

Цветущие растения имеют уникальную систему полового воспроизводства, называемую «двойное оплодотворение», в которой каждая из сперматозоидов точно сливается с яйцеклеткой или центральной клеткой. Таким образом, два независимых события оплодотворения происходят почти одновременно. Оплодотворенная яйцеклетка и центральная клетка развиваются в зиготе и эндосперме, соответственно. Поэтому для последующего развития семян необходим точный контроль за двойным оплодотворением. Двойное оплодотворение происходит в женском гаметофите (эмбрио-мешок), который глубоко скрыт и покрыт толстыми тканями яйчи и яичников. Эта конструкция пестильной ткани затрудняет наблюдение и анализ двойного оплодотворения и создает нынешнюю ситуацию, в которой многие вопросы, касающиеся механизма двойного оплодотворения, остаются без ответа. Для функциональной оценки потенциального кандидата на оплодотворение важен фенотипический анализ оплодотворения. Для того чтобы судить завершение оплодотворения в Arabidopsis thaliana,формы сигналов флуоресценции маркируя ядра спермы использованы как индикаторы. Клетка спермы которая не усваивает показана сжатым сигналом флуоресценции вне женского gametes, тогда как клетка спермы которая успешно оплодотворяет показана decondensed сигналом из-за karyogamy с женским ядром gametes. Описанный здесь метод предоставляет инструмент для определения успешного или неудачного оплодотворения в условиях in vivo.

Introduction

Цветущие растения производят семена путем двойного оплодотворения, процесс, который непосредственно контролируется взаимодействия миноносов, локализованных на гамете плазменной мембраны1,2. Цветущее растение самцов гамет, пара сперматозоидов, развивается в пыльце. Пыльца трубки, которая растет после опыления поставляет пару сперматозоидов для женщин гамет, яйцеклетки и центральной клетки, которые развиваются в эмбриона мешок. После того, как встречаются самцы и женщины- гаметы, белки на поверхности гамет способствуют распознаванию, привязанности и синтезу для полного двойного оплодотворения. В предыдущих исследованиях, мужские гаметовые мембранные белки GENERATIVE CELLSPECIFIC 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2) 3,4 и GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2)5 были определены как регуляторы оплодотворения, участвующие в синтезе гамет и вложения, соответственно. Недавно мы определили мужской гамет-специфический мембранный белок, DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9), как регулятор оплодотворения, участвующий в взаимодействии гамет. Мы обнаружили, что уменьшение экспрессии DMP9 приводит к значительному ингибированию оплодотворения яйцеклеток во время двойного оплодотворения в A. thaliana6.

Как двойное оплодотворение происходит в эмбриона мешок, который встроен в яйлю, которая дополнительно обернутые с яичников ткани, трудно наблюдать и анализировать состояния двойных процессов оплодотворения. По этой причине до сих пор существует много неясных моментов, которые препятствуют полному пониманию всего механизма контроля за двойным оплодотворением. Создание методов наблюдения для отслеживания поведения гамет во время двойного оплодотворения в условиях in vivo необходимо для функционального анализа потенциальных кандидатов на органы оплодотворения. Недавние исследования дали маркерные линии, где гамет субклеточные структуры помечены флуоресцентными белками. В этой статье мы демонстрируем простой и быстрый протокол для наблюдения за двойным оплодотворением, которое произошло в эмбриональном мешке, полученном из искусственно опыляемых пестики. Использование сперматозоидов ядро маркера линии HTR10-mRFP7, состояние оплодотворения каждой женщины гаметы могут быть дискриминированы на основе спермы ядерной морфологии сигнала. Наш протокол, посвященный такому морфологическому изменению ядер спермы при оплодотворении, может эффективно получить достаточное количество данных для статистического подтверждения. DMP9-нокдаун линии с HTR10-mRFP фон (DMP9KD/HTR10-mRFP) был использован в качестве мужских растений, чтобы показать одну модель оплодотворения. Протокол также подходит для функционального анализа других регуляторов оплодотворения.

Protocol

1. Искусственное опыление ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом процесса требуется пара щипков No 5. Выращивайте A. thaliana (Col-0) при 22 градусах Цельсия при 16-h светлом/8-h темном цикле в камере роста.ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезать и удалить первый развитый цветок стебель …

Representative Results

Овулы из пестика, опыляемые DMP9KD/HTR10-mRFP, были собраны при 7-8 HAP и соблюдены. Большинство овулей содержали два деконденсированных mRFP-маркированных ядер спермы в яйцеклетки (микропилярной стороне) и центральной клетке (charazal конц?…

Discussion

HTR10-mRFP этикетки отцовского хроматина (т.е. визуализирует ядра сперматозоидов), и динамика в двойном оплодотворении были зарегистрированы7. Сразу же после выпуска из пыльцы трубки, HTR10-mRFP помечены ядра спермы по-прежнему конденсируются. Тем не менее, каждый из ядер спермы deconden…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Японским обществом содействия науке KAKENHI грант (JP17H05832 т. И.) и за счет финансирования из стратегического приоритетного программы содействия исследованиям по фитохимическим растениям молекулярных наук, Университет Тиба (Япония).

Materials

BX51 Olympus Epifluorescence microscope
Cover glass Matsunami glass C018181
DMP9KD/HTR10-mRFP Arabidopsis thaliana, HTR10-mRFP background
Takahashi et al. (2018)6
Double-sided tape Nichiban NW-15S 15 mm width
DP72 Olympus Degital camera
Forceps Vigor Any No. 5 forceps are available
Growth chamber Nihonika LPH-411PFQDT-SP
HTR10-mRFP Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0 (Col-0) background
Ingouff et al. (2007)7
Injection needle Terumo NN-2719S 27 gauge
Slide glass Matsunami glass S9443
SZX9 Olympus Dissecting microscope
U-MRFPHQ Olympus Fluorescence Filter Cube (Excitation: BP535-555, Emission: BA570-625, Dichromatic mirror:DM565)
UPlanFL N 40x Olympus Objective lens (NA 1.3), oil-immersion
UPlanSApo 20x Olympus Objective lens (NA0.75), dry

References

  1. Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
  2. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
  3. Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
  4. von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
  5. Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
  6. Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076 (2018).
  7. Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
  8. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  9. Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690 (2013).
  10. Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
  11. Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
  12. Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).

Play Video

Cite This Article
Takahashi, T., Igawa, T. Evaluation of Fertilization State by Tracing Sperm Nuclear Morphology in Arabidopsis Double Fertilization. J. Vis. Exp. (150), e59916, doi:10.3791/59916 (2019).

View Video