Forskning sentrert rundt ekstracellulære blemmer (EV), spesielt exosomes, en type EV spenner 30-120 NM og preget av tilstedeværelsen av tre tetraspanin markører CD81, CD9, og CD63, har i stor grad blitt formet av utviklingen av metoder for å isolere og rense blemmer av interesse. Evnen å analysere mangesidig mekanismer har blitt hindret på grunn av komplekse og tidkrevende teknikker som genererer prøver bestående av en heterogen befolkning av blemmer generert via ulike trasé med et bredt spekter av innhold, størrelser, og Tettheter. Selv om dette er et problem for nesten alle EV forskning, er det av særlig betydning når man studerer EV ‘ er i sammenheng med viral infeksjon, som virions og virus-lignende partikler (VLPs) kan være lik i diameter til blemmer av interesse. For eksempel, humant immunsvikt virus type 1 (HIV-1) er ca 100 NM i diameter, som er omtrent samme størrelse som mange typer av EV ‘ er. Derfor har vi utviklet en ny EV-isolasjons arbeidsflyt for å løse disse problemene.

Den nåværende gullstandarden for EV-isolering er ultracentrifugation. Denne teknikken gjør bruk av de ulike vesicle tettheten, som gjør at blemmer å bli separert av sentrifugering med differensial sedimentering av høyere tetthet partikler versus lavere tetthet partikler på hver etappe ^1,2. Flere lav hastighet sentrifugering trinn er nødvendig for å fjerne intakte celler (300-400 x g i 10 min), celle rusk (~ 2 000 x g i 10 min), og apoptotisk organer/store blemmer (~ 10 000 x g i 10 min). Disse innledende renselser etterfølges av høyhastighets ultracentrifugation (100000-200000 x g for 1,5-2 h) til sediment EV-biler. Vasketrinn utføres for å ytterligere sikre EV renhet, men dette resulterer i reduksjon av antall isolerte el-biler, og dermed senke total yield ^3,4. Denne metoden ‘ s nytte er ytterligere begrenset av kravet om et stort antall celler (ca 1 x 10⁸) og et stort utvalg volum (≫ 100 ml) for å oppnå tilstrekkelige resultater.

For å møte de økende bekymringene, har utfelling av blemmer med hydrofile polymerer blitt en nyttig teknikk de siste årene. Polyetylen glykol (PEG), eller andre relaterte nedbør reagenser, gjør det mulig for brukeren å trekke ned blemmer, virus og protein eller protein-RNA-aggregater i en prøve ved å incubating prøven med reagens av valget, etterfulgt av en enkelt lav hastighet sentrifugering^1,2,5. Vi har tidligere rapportert at bruk av PEG eller relaterte metoder for å fremskynde EV ‘ s i forhold til tradisjonelle ultracentrifugation resultater i en betydelig høyere avkastning⁶. Denne strategien er rask, enkel, krever ikke ekstra kostbart utstyr, er lett skalerbar, og beholder EV struktur. På grunn av den tilfeldige karakteren til denne metoden, inneholder de resulterende prøvene en rekke produkter, inkludert frie proteiner, protein komplekser, en rekke av EV ‘ r, og virions som dermed krever ytterligere rensing for å oppnå ønsket befolkning^{1 ,2,7,8}.

For å overvinne heterogenitet av EV ‘ er innhentet fra ulike utfelling metoder, er tetthet gradient ultracentrifugation (DG) benyttet for å bedre separate partikler basert på deres tetthet. Denne metoden utføres ved hjelp av en trinnvis gradering ved hjelp av en tetthet gradient medium, for eksempel iodixanol eller sukrose, som gjør det mulig for separasjon av EV ‘ r fra proteiner, protein komplekser, og virus eller virus-lignende partikler (VLPs). Det er viktig å merke seg at mens det en gang var antatt at DG tillot mer presis separasjon av EV-subpopulasjoner, er det nå kjent at størrelser og tetthet av ulike blemmer kan overlappe hverandre. For eksempel er exosomes kjent for å ha flyte tettheten av 1.08-1.22 g/mL⁹, mens blemmer isolert fra GOLGI (COPI⁺ or clathrin⁺) har tettheten av 1.05-1.12 g/ml og de fra endoplasmatiske retikulum (COPII⁺ ) sediment ved 1.18-1,25 g/ml^1,2,3,4,9. I tillegg, hvis man ønsker å sammenligne exosomal fraksjoner mot fraksjoner som inneholder virale partikler, kan dette bli vanskeligere avhengig av tettheten av viruset av interesse-det er virus enn HIV-1 som trolig likevekt på samme tetthet som exosomal positive fraksjoner².

Til slutt er berikelse av EV-forbereder for nedstrøms visualisering og funksjonelle analyser avgjørende for EV-forskning. Bruken av EV-berikende nanopartikler, spesielt, multi-funksjonelle hydrogel partikler som spenner 700-800 NM i diameter, er et kritisk skritt for å oppnå konsentrert EV forbereder. De har en høy affinitet aromatiske agn som innkapslet av en porøs ytre sikt skall å fremme selektivitet. Nanopartikler som benyttes i denne studien omfatter to forskjellige preparater med ulike kjerne agn (reaktiv rød 120 NT80; og Cibacron Blue F3GA NT82) som har vist å øke fangst av EV ‘ r fra ulike reagenser og biofluids (se tabell over materialer )^{6,10,11,12,13,14,15}. Partiklene tilbyr enkel berikelse av EV ‘ r fra mange start materialer, inkludert iodixanol fraksjoner, cellekultur supernatanten, samt pasient biofluids som plasma, serum, cerebral spinal væsker (CSF) og urin^6,13 .

Metoden som presenteres her forbedrer effektiviteten av dagens EV rensing teknikker ved å kombinere flere teknologier; EV nedbør, tetthet gradient ultracentrifugation, og partikkel fangst, for å effektivisere arbeidsflyten, redusere prøve krav, og øke avkastningen for å få en mer homogen EV prøve for bruk i all EV forskning. Denne metoden er spesielt nyttig i etterforskningen av EV ‘ r og deres innhold under viral infeksjon som inkluderer en 0,22 μm filtrerings trinn for å utelukke store, uønskede blemmer og VLPs og separasjon av den totale EV befolkningen basert på tetthet til effektivt isolere EV ‘ r fra virions.