Summary

Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus

Published: September 12, 2019
doi:

Summary

Questo protocollo isola le vesciche extracellulari (EV) lontano dai virioni con elevata efficienza e resa incorporando precipitazioni EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle per consentire un flusso di lavoro semplificato e una riduzione dell’avvio volume, con conseguente preparazione riproducibile per l’uso in tutte le ricerche EV.

Abstract

Uno dei principali ostacoli nel campo della ricerca sulla vescicolo extracellulare (EV) oggi è la capacità di ottenere preparati EV purificati in un ambiente di infezione virale. Il metodo presentato ha lo scopo di isolare i VE lontano dai virioni (cioè L’HIV-1), consentendo una maggiore efficienza e resa rispetto ai metodi di ultracentrifugazione convenzionali. Il nostro protocollo contiene tre passaggi: precipitazione EV, separazione del gradiente di densità e cattura delle particelle. I saggi a valle (ad esempio, western blot e PCR) possono essere eseguiti direttamente dopo la cattura delle particelle. Questo metodo è vantaggioso rispetto ad altri metodi di isolamento (ad esempio, ultracentrifugation) in quanto consente l’uso di volumi di partenza minimi. Inoltre, è più facile da usare rispetto ai metodi alternativi di isolamento EV che richiedono più passaggi di ultracentrifugation. Tuttavia, il metodo presentato è limitato nella sua portata di saggi EV funzionali in quanto è difficile elusioni esitari dalle nostre particelle. Inoltre, questo metodo è adattato a un ambiente strettamente basato sulla ricerca e non sarebbe commercialmente fattibile.

Introduction

La ricerca incentrata sulle vescicle extracellulari (EV), in particolare gli esosomi, un tipo di Veicoli che vanno 30-120 nm e caratterizzato dalla presenza di tre marcatori tetraspanina CD81, CD9 e CD63, è stato in gran parte modellato dallo sviluppo di metodi per isolare e purificare le vesciche di interesse. La capacità di sezionare meccanismi sfaccettati è stata ostacolata a causa di tecniche complesse e dispendiose in termini di tempo che generano campioni composti da una popolazione eterogenea di vescicoli generati attraverso percorsi diversi con una vasta gamma di contenuti, dimensioni e Densità. Anche se questo è un problema per quasi tutte le ricerche EV, è di particolare importanza quando si studiano i vesc nel contesto dell’infezione virale, poiché i virioni e le particelle simili a virus (VLP) possono avere un diametro simile a quello delle vesciche di interesse. Ad esempio, il virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) ha un diametro di circa 100 nm, che ha all’incirca le stesse dimensioni di molti tipi di veicoli elettrici. Per questo motivo, abbiamo progettato un nuovo flusso di lavoro di isolamento EV per risolvere questi problemi.

L’attuale gold standard di isolamento EV è l’ultracentrifugazione. Questa tecnica si avvale delle varie densità vescicolari, che permettono alle vescicoli di essere separate dalla centrifugazione differenziale con sedimentazione differenziale di particelle ad alta densità rispetto a particelle a densità inferiore in ogni fase 1,2. Sono necessari diversi gradini di centrifugazione a bassa velocità per rimuovere le cellule intatte (300-400 x g per 10 min), i detriti cellulari (2.000 x g per 10 minuti) e i corpi apoptotici e le grandi vesciche (10.000 x g per 10 min). Queste purificazioni iniziali sono seguite da ultracentrifugazione ad alta velocità (100,000-200,000 x g per 1,5-2 h) per sedimentare EV. Vengono eseguite fasi di lavaggio per garantire ulteriormente la purezza dei veicoli elettrici, tuttavia, ciò comporta la riduzione del numero di VE isolate, riducendo così la resa totale 3,4. L’utilità di questo metodo è ulteriormente limitata dal requisito di un gran numero di celle (circa 1 x 108) e un grande volume di campionamento (> 100 mL) per ottenere risultati adeguati.

Per affrontare le crescenti preoccupazioni, la precipitazione delle vescicole con polimeri idrofili è diventata una tecnica utile negli ultimi anni. Il glicole in polietilene (PEG), o altri reagenti di precipitazioni correlati, consente all’utente di abbattere le vescicole, i virus e gli aggregati proteina o proteina-RNA all’interno di un campione semplicemente incubando il campione con il reagente di scelta, seguito da un singolo centrifugazione1,2,5. Abbiamo già riferito che l’uso di PEG o metodi correlati per precipitare EV rispetto ai tradizionali risultati di ultracentrifugazione in un rendimento significativamente più alto6. Questa strategia è veloce, facile, non richiede ulteriori attrezzature costose, è prontamente scalabile e mantiene la struttura EV. Tuttavia, a causa della natura promiscua di questo metodo, i campioni risultanti contengono una varietà di prodotti tra cui proteine libere, complessi proteici, una gamma di EV e virioni che richiedono quindi un’ulteriore purificazione per ottenere la popolazione desiderata1 ,2,7,8.

Per superare l’eterogeneità dei VE ottenuti da vari metodi di precipitazione, l’ultracentrifugazione del gradiente di densità (DG) viene utilizzata per separare meglio le particelle in base alla loro densità. Questo metodo viene eseguito utilizzando un gradiente stepwise utilizzando un mezzo di gradiente di densità, come iodixanol o saccarosio, che consente la separazione degli EV da proteine, complessi proteici e particelle di virus o virus (VLP). È importante notare che, mentre una volta si pensava che la DG consentisse una separazione più precisa delle sottopopolazioni EV, è ormai noto che le dimensioni e le densità delle varie vesciche possono sovrapporsi. Ad esempio, gli esosomi sono noti per avere densità di galleggiamento di 1,08-1,22 g/mL9, mentre le vescicole isolate dal Golgi (COPI ) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticulum endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticulum degli endoplasmici (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) hanno densità di 1,05-1,12 g/mL e quelle del reticolo endoplasmico (COPII) ) sedimento a 1,18-1,25 g/mL1,2,3,4,9. Inoltre, se si desidera confrontare le frazioni esosomiche con le frazioni contenenti particelle virali, questo può diventare più difficile a seconda della densità del virus di interesse, ci sono virus diversi dall’HIV-1 che probabilmente equilibrato allo stesso densità come frazioni positive esosomiche2.

Infine, l’arricchimento dei presupposti EV per la visualizzazione a valle e i saggi funzionali è fondamentale per la ricerca EV. L’uso di nanoparticelle che arricchiscono EV, in particolare, particelle di idrogel multifunzionali di 700-800 nm di diametro, sono un passo fondamentale per raggiungere prep EV concentrate. Possiedono un’esca aromatica ad alta affinità che incapsulata da un guscio di setaccio esterno poroso per promuovere la selettività. Le nanoparticelle utilizzate in questo studio includono due distinti preparati con esche di base diverse (Reactive Red 120 NT80; e Cibacron Blue F3GA NT82) che hanno dimostrato di aumentare la cattura dei veli da vari reagenti e biofluidi (vedi la Tabella dei Materiali )6,10,11,12,13,14,15. Le particelle offrono un facile arricchimento degli EV da numerosi materiali di partenza, tra cui frazioni di iodixanolo, colture cellulari supernatali, nonché biofluidi pazienti come plasma, siero, fluidi spinali cerebrali (CSF) e urina6,13 .

Il metodo qui presentato migliora l’efficienza delle attuali tecniche di purificazione dei videoimpres con diverse tecnologie; Precipitazione EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle, per semplificare il flusso di lavoro, ridurre i requisiti di campionamento e aumentare la resa per ottenere un campione EV più omogeneo da utilizzare in tutte le ricerche EV. Questo metodo è particolarmente utile nello studio dei veicoli elettrici e del loro contenuto durante l’infezione virale in quanto include un passaggio di filtrazione di 0,22 m per escludere le vesciche e i VLP di grandi dimensioni e indesiderati e la separazione della popolazione totale di Veicoli leggeri in base alla densità per isolare i veicoli elettrici dai virioni.

Protocol

1. Filtrazione e precipitazione delle vescibole extracellulari (EV) Per preparare il supernatante di coltura da cellule infette o transfected (cioè linee cellulari e/o cellule primarie), coltura circa 10 mL di cellule a ritardo di sangue per 5 giorni a 37 c e 5% DI CO2 nel mezzo di coltura appropriato (cioè, RPMI o DMEM con 10% bovini fetali siero [FBS]). NOT:</ Tutti i reagenti medi di coltura devono essere privi di veicoli elettrici e possono essere acquistati (vedi Tabel…

Representative Results

Le precipitazioni PEG aumentano la resa EVIl nostro approccio combinato all’isolamento EV è significativamente più efficiente in termini di recupero EV rispetto all’ultracentrifugazione tradizionale, come evidente dalla riduzione del 90% del volume di materiale di partenza richiesto. Ultracentrifugation, l’attuale gold standard in isolamento EV, richiede circa 100 mL di coltura supernatant per produrre un’adeguata preparazione EV per i test a valle, mentre il nostro…

Discussion

Il metodo delineato consente una maggiore resa evlari e la separazione del virus dagli eV utilizzando un approccio combinato all’isolamento. Quantità relativamente elevate di materiale di partenza (ad es. supernatante cellulare) possono essere filtrate prima dell’isolamento EV mediante precipitazioni, separazione della DG e arricchimento delle nanoparticelle, con un volume finale di 30 saggi a valle. L’uso dell’arricchimento delle nanoparticelle è essenziale in quanto, rispetto all’ultracentrifugazione tradizionale, qu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Kashanchi, in particolare Gwen Cox. Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health (NIH) Grants (AI078859, AI074410, AI127351-01, AI043894 e NS099029 a F.K.).

Materials

CEM CD4+ Cells NIH AIDS Reagent Program 117 CEM
DPBS without Ca and Mg (1X) Quality Biological 114-057-101
ExoMAX Opti-Enhancer Systems Biosciences EXOMAX24A-1 PEG precipitation reagent
Exosome-Depleted FBS Thermo Fisher Scientific A2720801
Fetal Bovine Serum Peak Serum PS-FB3 Serum
HIV-1 infected U937 Cells NIH AIDS Reagent Program 165 U1
Nalgene Syringe Filter 0.2 µm SFCA Thermo Scientific 723-2520
Nanotrap (NT80) Ceres Nanosciences CN1030 Reactive Red 120 core
Nanotrap (NT82) Ceres Nanosciences CN2010 Cibacron Blue F3GA core
Optima XE-980 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556-250mL Iodixanol
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 331362
Ultra-Clear Tube, 14x89mm Beckman Coulter 344059

References

  1. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods (San Diego, Calif). 87, 3-10 (2015).
  2. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
  3. Momen-Heravi, F., et al. Current methods for the isolation of extracellular vesicles. Biological Chemistry. 394 (10), 1253-1262 (2013).
  4. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  5. Boriachek, K., et al. Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles. Small (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (6), (2018).
  6. DeMarino, C., et al. Antiretroviral Drugs Alter the Content of Extracellular Vesicles from HIV-1-Infected Cells. Scientific Reports. 8 (1), 7653 (2018).
  7. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  8. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
  9. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. The Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  10. Sampey, G. C., et al. Exosomes from HIV-1-infected Cells Stimulate Production of Pro-inflammatory Cytokines through Trans-activating Response (TAR) RNA. The Journal of Biological Chemistry. 291 (3), 1251-1266 (2016).
  11. Ahsan, N. A., et al. Presence of Viral RNA and Proteins in Exosomes from Cellular Clones Resistant to Rift Valley Fever Virus Infection. Frontiers in Microbiology. 7, 139 (2016).
  12. Barclay, R. A., et al. Exosomes from uninfected cells activate transcription of latent HIV-1. The Journal of Biological Chemistry. 292 (28), 11682-11701 (2017).
  13. Pleet, M. L., et al. Ebola VP40 in Exosomes Can Cause Immune Cell Dysfunction. Frontiers in Microbiology. 7, 1765 (2016).
  14. Pleet, M. L., et al. Ebola Virus VP40 Modulates Cell Cycle and Biogenesis of Extracellular Vesicles. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  15. Anderson, M. R., et al. Viral antigens detectable in CSF exosomes from patients with retrovirus associated neurologic disease: functional role of exosomes. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 24 (2018).
  16. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica Et Biophysica Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  17. Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
  18. Schwab, A., et al. Extracellular vesicles from infected cells: potential for direct pathogenesis. Frontiers in Microbiology. 6, 1132 (2015).
  19. Narayanan, A., et al. Exosomes derived from HIV-1-infected cells contain trans-activation response element RNA. The Journal of Biological Chemistry. 288 (27), 20014-20033 (2013).
  20. Sami Saribas, A., Cicalese, S., Ahooyi, T. M., Khalili, K., Amini, S., Sariyer, I. K. HIV-1 Nef is released in extracellular vesicles derived from astrocytes: evidence for Nef-mediated neurotoxicity. Cell Death & Disease. 8 (1), e2542 (2017).
  21. Yang, L., et al. Exosomal miR-9 Released from HIV Tat Stimulated Astrocytes Mediates Microglial Migration. Journal of Neuroimmune Pharmacology: The Official Journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 13 (3), 330-344 (2018).
  22. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vanpouille, C., Margolis, L. Extracellular Vesicles Carry HIV Env and Facilitate Hiv Infection of Human Lymphoid Tissue. Scientific Reports. 7 (1), 1695 (2017).
  23. Jaworski, E., et al. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein. The Journal of Biological Chemistry. 289 (32), 22284-22305 (2014).
  24. Heinemann, M. L., et al. Benchtop isolation and characterization of functional exosomes by sequential filtration. Journal of Chromatography. A. 1371, 125-135 (2014).
  25. McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
  26. Heinemann, M. L., Vykoukal, J. Sequential Filtration: A Gentle Method for the Isolation of Functional Extracellular Vesicles. Methods in Molecular Biology. 1660, 33-41 (2017).
  27. Busatto, S., et al. Tangential Flow Filtration for Highly Efficient Concentration of Extracellular Vesicles from Large Volumes of Fluid. Cells. 7 (12), (2018).
  28. Andriolo, G., et al. Exosomes From Human Cardiac Progenitor Cells for Therapeutic Applications: Development of a GMP-Grade Manufacturing Method. Frontiers in Physiology. 9, 1169 (2018).
  29. Pleet, M. L., et al. Autophagy, EVs, and Infections: A Perfect Question for a Perfect Time. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 362 (2018).
  30. Richards, A. L., Jackson, W. T. Intracellular Vesicle Acidification Promotes Maturation of Infectious Poliovirus Particles. PLoS Pathogens. 8 (11), (2012).
  31. Taylor, M. P., Kirkegaard, K. Modification of Cellular Autophagy Protein LC3 by Poliovirus. Journal of Virology. 81 (22), 12543-12553 (2007).
  32. Jackson, W. T., et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery by RNA viruses. PLoS biology. 3 (5), e156 (2005).
  33. Suhy, D. A., Giddings, T. H., Kirkegaard, K. Remodeling the Endoplasmic Reticulum by Poliovirus Infection and by Individual Viral Proteins: an Autophagy-Like Origin for Virus-Induced Vesicles. Journal of Virology. 74 (19), 8953-8965 (2000).

Play Video

Cite This Article
DeMarino, C., Barclay, R. A., Pleet, M. L., Pinto, D. O., Branscome, H., Paul, S., Lepene, B., El-Hage, N., Kashanchi, F. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (151), e59876, doi:10.3791/59876 (2019).

View Video