ב Vivo הדמיה של התחבורה נוזל שדרתי דרך הגולגולת העכבר ללא שינוי באמצעות זריחה מאקרוסקופיה
Summary
Transcranial הדמיה אופטית מאפשרת הדמיה בשדה רחב של הובלה נוזל מוחי שדרתי בקליפת עכברים חיים דרך הגולגולת שלם.
Abstract
נוזל מוחי שדרתי (שדרתי) זרימת מכרסמים כבר נחקרו בעיקר באמצעות לשעבר vivo קוונפיקציה של מנותבים. טכניקות כגון מיקרוסקופ 2-פוטון ותהודה מגנטית (MRI) הופעלו בvivo פיקציה של זרימת שדרתי, אבל הם מוגבלים על ידי מופחתת הדמיה של כרכים ורזולוציה מרחבית נמוכה, בהתאמה. העבודה האחרונה מצאה כי שדרתי נכנס את המוח בתוך מכסמה דרך רשת של חללים perivascular סביב העורקים החודר של קליפת מכרסם. זה הזנה וסקולרית של שדרתי הוא הנהג העיקרי של מערכת glymphatic, מסלול מעורב בסיווג של מסיסות מטבולית רעילים (למשל, עמילואיד-β). כאן, אנו ממחישים טכניקת דימות מקרוסקופי חדש המאפשר בזמן אמת, הדמיה מזוסקופית של מעבר שדרתי מפני פלורסנט דרך הגולגולת ללא פגע של עכברים חיים. שיטה מינימלית פולשנית זו מקלה על המון עיצובים ניסיוניים ומאפשרת בדיקה בודדת או חוזרת של דינמיקה של שדרתי. למקלוסקופים יש רזולוציה גבוהה של מרחבי וזמני ומרחק העבודה הגדול שלהם מאפשר דימות בעת ביצוע משימות על מכשירים התנהגותיים. גישה זו הדמיה כבר אומת באמצעות שני פוטונים הדמיה מדידות פלואורסצנטית שהתקבלו מטכניקה זו מאוד לתאם עם vivo לשעבר וכימות של מכשירי רדיו בעלי התווית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד הדמיה transcranial מאקרוסקופי ניתן להשתמש כדי להעריך את התחבורה הגלימפטית בעכברים חיים, המציעה חלופה נגישה ליותר שיטות הדמיה יקרות יותר.
Introduction
נוזל מוחי שדרתי (שדרתי) מרחץ את המוח ואת חוט השדרה והוא מעורב בשמירה על הומאוסטזיס, אספקת חומרים מזינים, ויסות לחץ תוך-גולגולתי1. מוחי שדרתי במרחב התת-ארכיוניאיד נכנס למוח דרך רשת של חללים פריכריים (PVS) המקיפים את העורקים הקורטיקליים ולאחר מכן זורמים לאורך העורק העורקי2. פעם אחת ב-כימומה, שדרתי החלפת עם נוזל ביניים (הקרן), נושאת מטבוליטים מזיקים כגון עמילואיד-β (Aβ) ו-טאו מצרפים החלבון מתוך המוח באמצעות התנגדות נמוכה החומר הלבן שטחי ומשטחים ורידים2,3 . מסלול זה תלוי בערוצי האסטרוגליאל aquaporin-4 (AQP4) ולכן כינה את מערכת glial-הלימפה (גלימפחטיק)4. פסולת מוצרים של נוירופיל מנוקה בסופו של דבר מתוך שדרתי-הקרן דרך כלי הלימפה ליד עצבי הגולגולת בתוך קרום המוח לעבר בלוטות הלימפה צוואר הרחם5. הכישלון של מערכת זו היה מעורב במספר מחלות נוירולוגיים כגון מחלת אלצהיימר6,7, פגיעה מוחית טראומטית3, והסכמי שבץ מדמם8.
הובלה בלתי מגנטית ניתן לדמיין על ידי החדרת מנותבים לתוך cisterna מגנה (CM)9,10 ומחקרים גלימפהטיים בעבר היו מנוצלים בעיקר 2-פוטון מיקרוסקופ4,11,12, 13, דימות תהודה מגנטית (MRI) 14,15,16,17, ו vivo ex הדמיה3,6,11, 18 להערכת קינטיקה מעקב. 2-פוטון מיקרוסקופ היא שיטה מתאימה עבור הדמיה מפורטת של מעקב שדרתי ב PVSs ואת הסרכימה בשל הרזולוציה המרחבית גבוהה שלה, עם זאת, יש שדה צר של השקפה והוא דורש חלון הגולגולת פולשני או דליל של הגולגולת. Vivo Ex הדמיה, בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, מאפשר ניתוחים מדורגת החל מתאים בודדים עד המוח כולו19. עם זאת, תהליך הפרזיה-קיבעון הנדרש להתבונן ברקמה שלאחר המוות, מייצר שינויים עמוקים בכיוון הזרימה השדרתי ומכווץ את ה-PVS, משנה באופן משמעותי את ההפצה ואת המיקום של המשדרים12. לבסוף, בעוד שהאמ-אר-איי יכול לעקוב אחר זרימת המוח המוחית לאורך כל הגוף האנושי ומכל האדם, היא חסרה ברזולוציה מרחבית וזמנית של זרימה פרימורית.
טכניקה חדשה, הדמיה transcranial מאקרוסקופי, פותרת חלק ממגבלות אלה על ידי הפעלת הדמיה של שדה רחב של הובלה שדרתי הפריסקולרית בקליפת המוח כולה של עכברים חיים. סוג זה של דימות מתבצע עם מאקרוסקופ פלורסנטי באמצעות קוביית מסנן multiband, מקור אור LED מהיר ויעילות גבוהה מצלמת CMOS10. אלה להגדיר קופצים מסוגלים לפתור PVSs עד 1-2 מ”מ מתחת למשטח הגולגולת והוא יכול לזהות fluorophores עד 5-6 מ”מ מתחת לפני השטח קליפת המוח תוך השארת הגולגולת לגמרי שלמים10. מסננים multiband ו נוריות שיכולות לכוונן במהירות את אורך הגל מאפשר השימוש fluorophores מרובים ומאפשר שימוש בחומרים מסוימים של שדרתי להיות מתויג עם מסומנים של משקולות מולקולרית שונים תכונות כימיות באותו ניסוי.
הליך זה דורש ניתוח פשוט, מינימלית פולשנית כדי לחשוף את הגולגולת ולמקם צלחת ראש במשקל קל כדי לייצב את הראש במהלך הפעלת ההדמיה. ניתן להעביר את המשדרים לתוך ס מ ללא קידוח לתוך הגולגולת או לחדור לרקמת קליפת המוח באמצעות פיפטות או באמצעות צינורית9,20. שתי הצינורית ולוחיות הראש של ה-CM נשארות יציבות במשך מספר ימים עד שבועות ומקלות את העיצובים הניסיוניים המורכבים יותר בהשוואה להדמיה הקלאסית של נקודת הסיום. פרוטוקול זה מתאר כיצד הדמיה transcranial מאקרוסקופי משמש לחקר פונקציית מערכת גלימפהטית בעקבות הזרקה חריפה או כרונית של מעקב שדרתי הפלורסנט לתוך CM של מורדם/שינה או לישון עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו לתאר פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה transcranial שדרתי בעכברים חיים באמצעות מסחרית-זמין מקרוסקופים פלורסנט ו מנותבים. טכניקה זו פשוטה ומינימלית-פולשנית, אך כמותית. בהדמיה vivo מתואם היטב עם שיטות רגישות כגון ספירת מבחנות של מכשירי רדיו המסומנים ב- 3כ-dextran ו -14ג-אינולין לאחר משלוח CM, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ המכון הלאומי על הזדקנות (מכוני הבריאות הלאומי של ארה ב; R01NS100366 ו-RF1AG057575 ל-MN), תוכנית מצוינות לרשתות טראנס-אטלנטית, ואופק האיחוד האירופי 2020 תוכנית מחקר וחדשנות (מענק מס ‘ 666881; היעד של SVDs @). אנחנו גם רוצים להודות לדן Xue לקבלת סיוע מומחה עם איורים גרפיים.
Materials
| 0.25% Bupivacaine HCl | University of Rochester Vivarium | ||
| 100 µL Gastight Syringe Model 1710 TLL, PTFE Luer Lock | Hamilton Company | 81020 | |
| A-M Systems Dental Cement Powder | Fisher Scientific | NC9991371 | |
| Carprofen | University of Rochester Vivarium | ||
| Chlorhexidine | Prevantics | B10800 | |
| CMOS Camera | Hammamatsu | ORCA Flash 4.0 | |
| Head Plate | University of Rochester | No catalog # | Custom made at the machine shop at the University of Rochester |
| High-Temperature Cautery | Bovie Medical Corporation | AA01 | |
| Insta-set Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-151 | |
| Isoflurane – Fluriso | Vet One | 502017 | University of Rochester Vivarium |
| Ketamine | Strong Memorial Hospital Pharmacy | ||
| Krazy Glue | Elmer's Products, Inc | No catalog #, see link in comments | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG |
| Micropore Surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-aldrich | P6148 | |
| PE10 – Polyethylene .011" x .024" per ft., 100 ft. continuous | Braintree Scientific | PE10 100 FT | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Dual Syringe | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| PURALUBE VET OINTMENT | Dechra | ||
| Puritan PurSwab Cotton Tipped Cleaning Sticks | Fisher Scientific | 22-029-553 | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| Simple Head Holder Plate (for mice) | Narishige International USA Inc | MAG-1 | |
| Single-use Needles, BD Medical | VWR | BD305106 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Tunable LED | PRIOR Lumen 1600-LED | ||
| Xylazine | University of Rochester Vivarium |
References
- Tumani, H., Huss, A., Bachhuber, F. The cerebrospinal fluid and barriers – anatomic and physiologic considerations. Handbook of Clinical Neurology. , 21-32 (2017).
- Jessen, N. A., Munk, A. S., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochemical Research. 40 (12), 2583-2599 (2015).
- Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiology of Disease. 93, 215-225 (2016).
- Da Mesquita, ., S, , et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer’s disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
- Gaberel, T., et al. Impaired glymphatic perfusion after strokes revealed by contrast-enhanced MRI: a new target for fibrinolysis. Stroke. 45 (10), 3092-3096 (2014).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. 10 (135), (2018).
- Plog, B. A., et al. Transcranial optical imaging reveals a pathway for optimizing the delivery of immunotherapeutics to the brain. JCI Insight. 3 (23), (2018).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Annals of Neurology. 76 (6), 845-861 (2014).
- Mestre, H., et al. Flow of cerebrospinal fluid is driven by arterial pulsations and is reduced in hypertension. Nature Communications. 9 (1), 4878 (2018).
- Xie, L., et al. Sleep drives metabolite clearance from the adult brain. Science. 342 (6156), 373-377 (2013).
- Plog, B. A., Nedergaard, M. The Glymphatic System. in Central Nervous System Health and Disease: Past, Present, and Future. Annual Review of Pathology. 13, 379-394 (2018).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1299-1309 (2013).
- Davoodi-Bojd, E., et al. Modeling glymphatic system of the brain using MRI. Neuroimage. 188, 616-627 (2019).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. The Journal of Neuroscience. 35 (31), 11034-11044 (2015).
- Hablitz, L. M., et al. Increased glymphatic influx is correlated with high EEG delta power and low heart rate in mice under anesthesia. Science Advances. 5 (2), (2019).
- Rasmussen, M. K., Mestre, H., Nedergaard, M. The glymphatic pathway in neurological disorders. The Lancet Neurology. 17 (11), 1016-1024 (2018).
- Mestre, H., et al. Aquaporin-4-dependent glymphatic solute transport in the rodent brain. Elife. 7, (2018).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7, 11100 (2016).
- Munk, A. S., et al. PDGF-B Is Required for Development of the Glymphatic System. Cell Reports. 26 (11), 2955-2969 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ren, Z., et al. Hit & Run’ model of closed-skull traumatic brain injury (TBI) reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (6), 834-845 (2013).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of traumatic injury are transported from brain to blood via the glymphatic system. The Journal of Neuroscience. 35 (2), 518-526 (2015).
- Ma, Q., Ineichen, B. V., Detmar, M., Proulx, S. T. Outflow of cerebrospinal fluid is predominantly through lymphatic vessels and is reduced in aged mice. Nature Communications. 8 (1), 1434 (2017).
- Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Ma, Q., et al. Rapid lymphatic efflux limits cerebrospinal fluid flow to the brain. Acta Neuropathologica. 137 (1), 151-165 (2019).
- Silasi, G., Xiao, D., Vanni, M. P., Chen, A. C., Murphy, T. H. Intact skull chronic windows for mesoscopic wide-field imaging in awake mice. Journal of Neuroscience Methods. 267, 141-149 (2016).
