التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس
Summary
التعبير وتنقية البروتينات التي تحتوي على مجال هيدرولاز fumarylacetoacetatee مع أمثلة (التعبير في E. القولونية، FPLC). وتستخدم البروتينات النقية لإنتاج التبلور والأجسام المضادة وتستخدم في اختبارات الإنزيم. يتم تقديم اختبارات ضوئية مختارة لعرض وظائف متعددة من FAHD1 كما ديكاربوكسيلاز أوكسالوأسيتات وأسيلففات هيدرولاز.
Abstract
البروتينات التي تحتوي على حقول هيدرولاز (فهد) هي من أفراد الأسرة الفائقة التابعة لـ FAH في الإيكريوتيات. تعرض إنزيمات هذه العائلة الفائقة بشكل عام وظائف متعددة، تتضمن بشكل رئيسي آليات هيدرولاز وديكاربوكسيلاس. يعرض هذا المقال سلسلة من الطرق المتتالية للتعبير عن بروتينات فهد وتنقيتها، وأساساً ببروتين فهد 1 (فهد 1) تقويم العظام بين الأنواع (الإنسان، الفأر، الديدان الخيطية، النباتات، إلخ). والأساليب المغطاة هي تعبير البروتين في E. coli، والكروماتوغرافيا التقارب ، والكروماتوغرافيا التبادل الأيون ، والترشيح جل إعدادي والتحليلي ، تبلور ، وانعراج الأشعة السينية ، واختبارات قياس ضوئي. بروتين مركز عالي النقاء (98٪ قد تستخدم لبلورة أو إنتاج الأجسام المضادة. البروتينات ذات الجودة المماثلة أو الأقل قد تستخدم في اختبارات الإنزيم أو تستخدم كمستضدات في أنظمة الكشف (غرب-Blot، ELISA). في مناقشة هذا العمل، تم تحديد آليات الأنزيمية من FAHD1 لوصف هيدرولاز وdecarboxylase ثنائية الأداء في مزيد من التفاصيل.
Introduction
وfumarylacetoacetate hydrolase (FAH)1,2 عائلة فائقة من الإنزيمات يصف مجموعة من الإنزيمات التي تشترك في الحفاظ على نطاق حفية الحفازة 3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10. على الرغم من مركزها الحفاز المشترك، هذه الإنزيمات متعددة الوظائف، وتوجد معظمها في prokaryotes، حيث يتم استخدامها لكسر المركبات المستخرجة من مصادر الكربون المعقدة3. تم التعرف على ثلاثة أفراد فقط من هذه العائلة في eukaryotes حتى الآن: الاسم الذي يعطي FAH2،وكذلك البروتين الذي يحتوي على نطاق FAH 1 (FAHD1)11,12,13,14 15 والبروتين المحتوي على النطاق 2 من فاه (فهد 2). وقد ارتبط استنفاد FAHD1 مع ضعف التنفس الميتوكوندريا13،16 والمرتبطة بنوع قابل للعكس من النمط الظاهري الشيخوخة الخلوية14 التي ترتبط المحتملة المتوسطة أوجه القصور في نظام نقل الإلكترون. وقد أصبحت المتغيرات القابلة للدواء التي يمكن أن تكون ذات أهمية كبيرة هي HUMAN FAHD1 وتقويمها في الأنظمة النموذجية (الماوس، الخيطية، خطوط الخلايا السرطانية، النباتات، إلخ)، فضلاً عن متغيرات الطفرة التي تم اختيارها. لهذا البحث، البروتين المؤتلف في مستويات عالية من النقاء، فضلا عن معلومات عن الآليات الحفازة الموجهة من قبل هياكل الكريستال والأجسام المضادة الانتقائية أمر حيوي.
تصف هذه المخطوطة طرق التعبير عن بروتين فهد في القولونية،والكروماتوغرافيا التقاربية، والكروماتوغرافيا التبادلية للأيونات، وهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم، والترشيح الجل إعدادي والتحليلي، والتبلور، وانعف الأشعة السينية، و الاختبارات الضوئية. الغرض من الأساليب والبروتوكولات المذكورة هنا هو توفير التوجيه للعلماء العاملين في مجالات متنوعة مثل علم الجراثيم والبيولوجيا النباتية، فضلا عن الدراسات الحيوانية والبشرية، لتمييز أعضاء الأسرة الكبرى من أجل الصحة، بما في ذلك يجب أن تصبح ذات الصلة في مجال معين. البروتوكولات المذكورة هنا قد توفر دعما قيما للمشاريع التي تهدف إلى توصيف أفراد الأسرة الفائقة الأخرى prokaryotic أو eukaryotic FAH.
الأساس المنطقي وراء الأساليب الموصوفة هنا هو حقيقة أنه لوصف البروتينات سيئة الوصف (على وجه الخصوص، الإنزيمات الأيضية غير معروفة الأهمية الفسيولوجية)، والنهج للبدء مع البروتينات المؤتلفة النقية يسمح لل تطوير أدوات بحثية لا تقدر بثمن وعالية الجودة مثل مستحضرات الإنزيم النشطة في المختبر، والأجسام المضادة عالية الجودة، ومثبطات دوائية قوية ومحددة للإنزيمات المختارة. الطرق الموصوفة تتطلب بروتين سريع السائل الكروماتوغرافيا (FPLC) وأشعة إكس البلورات. ويمكن العثور على طرق بديلة (مثل التعبير عن البروتين دون الاستقراء الكيميائي، أو لعرض تنقية البروتين عن طريق التنقية بعد المعالجة الحرارية تليها إزالة الملحة والكروماتوغرافيا استبعاد حجم)، في مكان آخر17. في حين أن مجموعة أوسع من الأساليب المتاحة للتعبير وتنقية من الإنزيمات الأسرة الفائقة فاه2,7,9,17,18, هذا العمل يركز على التعبير و تنقية بروتينات فهد على وجه الخصوص.
في قسم المناقشة من هذه المخطوطة، تم وصف الآليات الحفازة المحددة لبروتين FAHD1 (هيدرولاز، ديكاربوكسيلاس)15 بمزيد من التفصيل، من أجل إظهار الطابع الكيميائي للتفاعلات المحفزة. البيانات التي تم الحصول عليها استنادا إلى العمل السابق7،15،18 (PDB: 6FOG، PDB: 6FOH) يعني نشاط ثالث من الإنزيم كما الكيتو ايزول إيزوماراز.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحرجة
بروتينات فهد حساسة جدا لتركيزات الملح. عند تركيزات الصوديوم المنخفضة، قد تترسب البروتينات عند الذوبان، ولكن عادة ما يمكن إعادة تشكيلها بشكل كامل في تركيزات الملح الأعلى. أي أنه إذا كان بروتين فهد يترسب لسبب ما، فقد يتم استرداده أو إعادة تركيبه بتركيزات ملحية أعلى (> 300 ميكرومتر). بعض البروتينات أكثر رهاب او ماء, ومع ذلك, قد لا يتم استرداد (على سبيل المثال, HUMAN FAHD2), ولكن المنظفات مثل CHAPS (الحد الأقصى 1%) أو الجلسرين (10%) يمكن استخدامها للحفاظ عليها في حل مستقر. على أي حال، ينصح بتجميد الصدمات باستخدام النيتروجين السائل والتخزين عند -80 درجة مئوية، كما هو لطيف وبطيء عملية الذوبان.
قد تحدث بعض المشاكل غير المتوقعة أثناء تنقية ني-NTA في الخطوة 3.1.10. وتجدر الإشارة إلى أن مادة OD أعلى في العينة الثانية التي تم جمعها مما كانت عليه في العينة الأولى تشير إلى وجود حجم كبير جداً من راتنج الأغاروز (أخذ ملاحظة واستخدام أقل من الراتنج في التجربة التالية). أيضا، وراتنج الأجاروز نفسه يؤدي إلى إشارة OD في 280 نانومتر (أي، وتعطيل السرير راتنج الأجاروز تعطي إشارات اصطناعية). في حالة الشك، ينصح باستخدام أساليب أخرى مثل برادفورد أو BSA اختبار لتحديد تركيزات البروتين.
في الاختبارات الأنزيمية، هناك ثلاثة جوانب حاسمة يجب النظر فيها. أولاً، تقييم تركيز البروتين أمر بالغ الأهمية للحصول على الأنشطة المحددة الصحيحة. مستوى نقاء البروتين يؤثر على النتيجة ويحتاج إلى تقدير. في حالة البروتين الموسومة، يجب حساب كتلة جزء العلامة، ويجب تصحيح النشاط المحدد في المقابل. وبالنسبة للاختبارات البسيطة الموصوفة في القسم 7 من البروتوكول، يكفي نقاء نُهُر ني-NTA للتمييز بين الركيزة النشطة وغير النشطة، والعوامل المساعدة، وما إلى ذلك. في حالة أكثر تعقيدا مايكليس-Menten الحركية، يجب تحديد جميع تركيزات رد الفعل والركيزة بشكل صحيح. خصوصا عند استخدام oxaloacetate (التي لصناعة السيارات decarboxylates مع مرور الوقت) يجب تصحيح الجزء الأنزيمي من رد فعل لصناعة السيارات في decarboxylation (على افتراض أن كلا التفاعليحدث في وقت واحد). يجب النظر في التغيرات الأولية في إشارة الكثافة البصرية الموجهة إلى الكيتو-إنول تودومومراتمن الركيزة. ثالثا، يجب تعديل التركيزات والأحجام. رد فعل مع تركيزات محددة من الإنزيم والركيزة قد تعطي نتائج مختلفة تعتمد على حجم الخفض. إذا كان هناك الكثير من الإنزيم في البئر، قد التصاق السائل في الواقع التحيز النتيجة.
لتقييم حركية Michaelis-Menten فمن المستحسن إجراء التجارب الأولية في 100 ميكرولتر، 200 ميكرولتر، و 300 ميكرولتر من أجل العثور على المزيج الأمثل. تنطبق جوانب مماثلة على نسبة تركيزات الإنزيم الركيزة للاختبارات الحركية. الكثير من الإنزيم لكل ركيزة أو الكثير من الركيزة لكل إنزيم وضع النظام خارج نطاق ماليس ثابت الدولة الخطية. ويلزم إجراء تجارب أولية لتحسين هذه الشروط. يتم توفير التعديل المثالي لبروتين FAHD1 البشري (النوع البري) في القسم 8، مما يؤدي إلى رسم تخطيطي حركي (كما هو معروض في الشكل 5B،على سبيل المثال).
لتبلور هو pipetted قطرة من محلول البروتين في وسط غطاء ومختلطة مع قطرة من كوكتيل تبلور، والذي يتكون عادة من العازلة (على سبيل المثال، تريس-حمض الهيدروكلوريك، HEPES) وسريع (على سبيل المثال، البولي ايثيلين جلايكول، الأمونيوم كبريتات). يمكن اختيارياً تطبيق قطرة محلول مثبط للبلورة المشتركة (مثل الأوكسالات في هذا البروتوكول). ثم يتم وضع coverslip رأسا على عقب فوق بئر من خزان يحتوي على كوكتيل تبلور، وختم الهواء جيدا ضيق مع مساعدة من النفط مانع التسرب (الشكل 6B). من الناحية المثالية، لا يحدث هطول الأمطار داخل قطرة في بداية التجربة مما يعني أن البروتين لا يزال في الحل. وبما أن التركيز السريع في الخزان أعلى منه في القطرة، فإن القطرة تبدأ في فقدان المياه عن طريق التبخر في الغلاف الجوي للبئر حتى يتم التوصل إلى التوازن مع الخزان. انتشار المياه في الخزان يسبب انخفاض بطيء في حجم الانخفاض الذي بدوره يسبب زيادة في كل من, البروتين والتركيز السريع في الانخفاض. إذا وصل محلول البروتين إلى الحالة المطلوبة من التشبع الفائق وبالتالي الاستقرار الفوقية، يمكن أن تحدث النوى التلقائية تليها نمو الكريستال. الوصول إلى الدولة التشبع هو شرط ضروري ولكن ليس كافيا للتبلور. تبلور البروتينات يحتاج على حد سواء، مواتية الحرارة والظروف الحركية، ويعتمد بشكل كبير على خصائص لا يمكن التنبؤ بها من البروتين أن تبلور22.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
قد يكون التعبير عن البروتين في E. القولونية غير فعالة. قد تحتاج تركيزات IPTG المختلفة، ودرجة حرارة التعبير، ووقت التضخيم، مثل درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات أو في غرفة باردة بين عشية وضحاها، إلى اختبار لكل بروتين جديد للعثور على الظروف المثلى. في بعض الأحيان لوحظ هطول البروتينات في الجسم الاشتمال لبروتينات فهد أكثر رهابا ً. في مثل هذه الحالات، ينصح التعبير البروتين في أنظمة نموذجية أخرى مثل خلايا الحشرات، كما الهيئات إدراج أقل احتمالا لتشكيل26.
حيث أن بروتينات فهد حساسة لتركيزات الملح والعوامل النافية، وكذلك درجة الـ حف، فإن استراتيجيات تنقية مختلف المتجانسات، وتقويم العظام، ومتغيرات الطفرة النقطية قد تختلف في البيئات الفردية. تم تطوير طرق التنقية الموصوفة لبروتين الفهد 1 من النوع البري. قد يكون تركيز المواد الكيميائية، مثل كلوريد الصوديوم وإيميدازول، وكذلك درجة الألف، قد يكون من الضروري تكييفها للبروتينات الفردية مع نقطة متساوية التساوي مختلفة (PI). أيضا من الجدير بالذكر، ليس كل له-الموسومة البروتين قد ربط جيدا إلى راتنج ني نتا. إذا كان البروتين ملزم لعمود ني-NTA غير فعال، والتركيزات المكيفة من كلوريد الصوديوم وإيميدازول، فضلا عن اختلاف شروط الحموضة في العازلة تشغيل ني-NTA قد تساعد على تحسين نوعية النتيجة. وإذا لم يكن الأمر كذلك، فإن تخطي خطوة ني-نتا والمضى قدماً إلى خطوة الفصل اللوني التبادلي الأيوني قد يؤدي أيضاً إلى استراتيجية تنقية ناجحة. إذا كان البروتين يرتبط بعمود Ni-NTA ولكن لا يمكن أن يكون من العمود، قد تساعد إضافة بعض MM EDTA في تعطيل مجمع Ni2+.
وفيما يتعلق بعملية التبلور، فإنه يلزم أن يكون مفهوما أن التنظيم الذاتي لجزيئات البروتين الكبيرة والمعقدة في شعرية دورية منتظمة هي عملية غير محتملة بطبيعتها تعتمد اعتمادا كبيرا على صعوبة التحكم في المعلمات الحركية. حتى التغييرات الصغيرة في مجموعة المتابعة المستخدمة لبلورة يمكن أن يغير بشكل كبير النتيجة وسوف تشكل أي بلورات. نقاء البروتين هو عموما ذات أهمية قصوى. وكقاعدة عامة، يجب أن هلام SDS-PAGE المثقل بشكل كبير لا تظهر العصابات الأخرى. أيضاً، قد يؤثر التسلسل الذي يتم تنفيذ الخطوات النتيجة. على سبيل المثال، لضمان إعادة الاستنساخ، فإنه من الضروري في كثير من الأحيان للحفاظ على تسلسل الأنابيب نفسه، ثم أولا إضافة البروتين، وأخيرا إضافة سريع إلى قطرة تبلور (أو العكس بالعكس). أيهما الطريقة المستخدمة، فإنه ينبغي أن تبقى هي نفسها عند محاولة إعادة إنتاج أو توسيع نطاق التجارب. إذا لوحظ عدم وجود بلورات بعد هذا البروتوكول، يمكن أن تختلف التركيبة الكيميائية السريعة، والرقم الألف، وحجم الإسقاط، ونسبة البروتين إلى الترسبات بزيادات صغيرة. الصبر والملاحظات الثابتة من قطرات هي الفضيلة.
ملاحظات على الآليات الحفازة للفهد 1
وقد تم تطوير الطرق المقدمة خصيصا للحصول على بروتينات FAHD1 ذات جودة عالية. هذا مكن نمو بلورات فهد1 وكذلك هندسة البلورات التي تحتوي على FAHD1 معقدة إلى مثبط (أوكسالات، PDB: 6FOG). توفر هياكل الأشعة السينية بنية ثلاثية الأبعاد لتجويف الإنزيم الحفاز. هذه النتائج إنشاء وصف شامل للمخلفات التي يحتمل أن تكون مهمة للآليات الحفازة لهذا الإنزيم مثيرة للاهتمام. وقد وصفت FAHD1 لأول مرة لتكون قادرة على cleave acylpyruvates (أسيتيلبيروفات، fumarylpyruvate)11. في وقت لاحق، وجد أن FAHD1 تعمل أيضا كdecarboxylase من oxaloacetate12. على الرغم من أن ركائز acylpyruvate وoxaloacetate هي moieties الكيميائية المختلفة، والتحولات الكيميائية تشترك ميكانيكيا الانقسام الاستراتيجي من مشترك واحد C3-C4 السندات، يسهل بنشاط إذا C3 – مدارات السندات C4 تبقى متعامدة إلى المدارات π من C2-carbonyl15. مثل هذا التشكل يسمح استقرارالرنين من C 3-carbanion شكلت بشكل عابر خلال عملية الانقسام. ركائز FAHD1 (أوكسالوأسيتات وacylpyruvates) هي جزيئات مرنة وقد توجد في الكيتون -enol(كيتو-انول) وكذلك أشكال C 2-رطب (الشكل9A). يتم تحديد التوازن بين الأنواع المختلفة بشكل رئيسي من خلال طبيعة تكوين العازلة المستخدمة، والحموضة ووجود الأيونات المعدنية. في ما يلي نناقش السيناريوهات الآلية الكهتية المستوحاة من تحليل هياكل الأشعة السينية الكريستالية التي كشفت عن مركز الحفاز من FAHD1.
الشكل 9 تفاصيل عن الآلية الحفازة المقترحة لـ FAHD1 البشرية.
(أ) Oxaloacetate موجود في دولة بلورية وكذلك في حل محايد أساسا في شكلz-enol24. ومع ذلك، تحت الفسيولوجية حفية الشروط شكل 2 كيتو هو التمثيل السائد25. (ب) رسم كيميائي لتجويف hFAHD115 مع أوكسالوأسيتات (يسار) وacylpyruvate (يمين، مع R1 كبقية عضوية؛ والسهم الأحمر يدل على هجوم نيوكليوفيليك من جزيء الماء استقرت المجاورة) (انظر المناقشة). (ج) مقارنة التشوهات المفضلةللانشقاق C 3-C4 في decarboxylase (b إلى c) وhydrolase (b’ إلى c) آلية FAHD1: تسفر كلتا العمليتين عن البيروفات-الإنوليت المعقد (انظر المناقشة). ومن المتوقع أن تستقر الوسيطتان ب و (ب) بحلول الربع 109، على النحو الوارد في الفريق باء (انظر المناقشة). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
نشاط ديكاربوكسيلاس من فهد1
Oxaloacetate موجود في دولة بلورية وكذلك في حل محايد أساسا في شكلz-enol24. ولكن تبين أنه في ظل الظروف الفسيولوجية للحُص (الظروف العازلة عند الرقم الـ 7.4) شكل 2-كيتو هو التمثيل السائد لأوكسالوأسيتات25 (الشكل9A)، وأن الإنولليس ليس شرطا ً مسبقاً لإزالة الكُبْرْكْر27 . ملاحظة, ملغ2+ الأيونات ليس لها تأثير على نسبة الأنواع oxaloacetate في درجة الألف الالوى 7.4 أو أقل من28. تحويل شكل كيتو الأوكسالوأسيتات إلى مركز الحفاز من FAHD1 (بتوجيه من oxalate ملزمة في الإنزيم المعقد (PDB: 6FOG15)) كشفت بقايا Q109 كمنظم التطابق من oxaloacetate ملزمة15. كما هو مبين في مادة أخرى15، الترابط الهيدروجين لمجموعة كربامويل Q109 استقرار الأوكسالوأسيتات – التشكل الناتجة عن التناوب حول C2-C3 السندات (الشكل9B، لوحة اليسار). ونتيجة لهذا التناوب، فإنالسندات C 3-C4 (التي ستُغلق) تعتمد شبه التخلص المتعامد بالنسبة إلى المدارات المننوعة في الكربون C2(الشكل9C). ويمكن إطلاق ثاني أكسيد الكربون. وسيكون المنتج الرئيسي لهذه العملية هو الرنين استقرت مغ-إيولات من بيروفات. ومن المعروف من التحقيقات من المجمعات oxaloacetate-Mg أن الأنولات يشكل مجمع الأكثر استقرارا28,29. على افتراض استقرار مماثل لmg-pyruvate الأنوليت المعقدة يمكن أن يتم حظر عامل مساعد من FAHD1، ولكن بقايا يسين K123 يمكن بروتون البيروفات-إينولات في توازن لحظر فقدان عامل مساعد15.
ويشير التفسير المعطى إلى أن البيروفات إنول وسيطاً متميزاً في وظيفة الأداة الحفازة للتقنية (FAHD1) . في هذه الخطوة في النموذج المفترض، لا توفر البيانات التجريبية أي إشارة أخرى عن سبب فتح الغطاء المغلق لإطلاق المنتج. يمكن أن يستنتج، مع ذلك، أن الآلية المقترحة تبدو وكأنها تثبيط إنزيم من قبل المنتج: يكشف الهيكل البلوري عن جزيء ماء مُحفظ في اتجاه الاتجاه نحو مركز FAHD1 الحفاز بواسطة بقايا H30 وE33 المقدمة في اللولب ة15، الذي يسبب على ربط الليجان وغطاء الإغلاق. إذا كان enol الأولية البقاء في توازن مع إينولات، يمكن أن تطفئ إينولات استقرار الرنين إلى بيروفات من قبل جزيء الماء. الهيدروكسيل الناتج ة يمكن أن تحل محل البيروفات من عامل الـ Mg الذي سيفتح عليه الغطاء. وأخيرا، سيتم استعادة المركز الحفاز في بيئة الميتوكوندريا. في هذا السيناريو الناقص، فإن جزيء الماء تجويف تعمل كحمض، على التوالي.
نشاط الهيدرولاز في فهد1
يتطلب نشاط هيدروليز من انزيم ضمنا تشكيل وسيط من نوكلوفيل الهيدروكسيل. وعادة ما توجد هذه الآلية في تركيبة مع النشاط الحفاز الحمضي ة القاعدة. حالة انتقالية من رد الفعل يجب أن تكون مستعدة عن طريق التحكم التشكلي من قبل سلاسل جانبية الأحماض الأمينية الحرجة في تجويف. في القياس على مناقشة وظيفة decarboxylase، سيتم وضع acylpyruvate الإنزيم ملزمة في شكل 2 كيتو تحت السيطرة التشكلية عن طريق ربط الهيدروجين من الأكسجين 4-كاربونيل إلى Q109 (الشكل9B، لوحة الحق). يكشف الهيكل البلوري لـ FAHD1 المؤكسد ة عن جزيء الماء المحفوظة في اتجاه اتجاه مركز الحفاز فهد1 ببقايا H30 وE33 التي تم تقديمها في حلزون قصير15. وE33-H30 دياد المختصة لdeprotonate المياه المتمركزة الاتجاه والهيدروكسيل الناتجة هي في التصرف المثالي لمهاجمة 4-carbonyl من acylpyruvate المقدمة تحت مراقبة التطابق ية من قبل Q10915.
وتجدر الإشارة إلى أنه تم اقتراح آلية مماثلة لـ FAH18. ومن المتوقع أن يؤدي الهجوم من قبل nucleophile هيدروكسيل إلى أنواع أوكسيانيون، التي استقرت على مدارية تسيطر C3-C4 السندات الانقسام (الشكل9C). في هذا النموذج، وC3-C4 دوران السندات (الشكل9C)يحدث بعد الهجوم النووي من قبل الهيدروكسيل شكلت المشار إليها في الشكل 9B (أي، فإنه يعد acylpyruvate لانشقاق السندات). المنتجات الأولية هي حمض الخليك وmg-pyruvate enolate. في هذا السيناريو الناقص، يمكن أن حمض الخليك إرواء enol إلى بيروفات وبالتالي مساعدة النزوح من المنتج. فوق حُسْرال الـ7.5 وفي وجود أيونات الممغ، توجد الـacylpyruvates في توازن بين أشكال الكيتو والإنول، وهذه الأخيرة في تفضيل طفيف30. وعلى الأرجح، فإن كلا الشكلين قادران على ربط العامل المساعد لـ FAHD1 تحت غطاء الإغلاق اللاحق. يتم إعاقة معالجة ركائز الميلانيك أسيلبيروفات بواسطة الإنزيم بسبب الهيكل المسطح للشكل enol. وC3-C4 انشقاق يؤدي إلى carbanion الفينيل دون استقرار صدى.
ولذلك، نقترح خطوة الكيتونال الحفاز ة التحضير لهجوم الهيدروكسيل النووي على أسيل كاربونيل. ومع ذلك، فإن عملية الكيتونز هذه تتطلب السيطرة على نقل البروتونات من مخلفات FAHD1، والتي من شأنها أن تعزو نشاط الإيزوماراز المتأصلة إلى FAHD1. ويقال أن حموضة الهيدروجين enol mg-bound يكشف عن زيادة عشرة آلاف أضعاف بالمقارنة مع شكل غير معقد28. [دبروتونأيشن] من ال [مغ] ملزمة [إنول-فورم] كنت يمكن ممكنة ب [أون-بروتوند] [ك123]. يمكن أن يساعد البروتون من K123 من قبل كاربوكسيليت من D102. يمكن لشبكة السندات الهيدروجين التي شكلتها بقايا D102-K47 K123 تعمل كما تتابع البروتون اللازمة في مركز الحفاز من فهد11. ويمكن بعد ذلك أن يتم إخماد هذه الإيولات المتوسطة التي شكلت من قبل E33-H30-H20 الثالوث تحت الكيتونز من الركيزة15. شكل 2 كيتو سوف تأتي تحت السيطرة التطابقية من Q109، والهيدروكسيل شكلت في وقت واحد من شأنه أن يهاجم الكربونيل أسيل. المناقشة الموجزة تعني السيطرة على FAHD1 حول جزيء الماء للتبديل بين الحمض والقاعدة من خلال التفاعل بين بقايا تشكيل تجويف.
التطبيقات المستقبلية أو اتجاهات الأسلوب
تطبيقات المستقبل من الأساليب المذكورة هنا عديدة. لا يزال عدد كبير من أعضاء الأسرة الكبرى من “فاه” ينتظرون التوصيف الوظيفي. وحتى المعلومات المتاحة عن الأنشطة الحفازة لأفراد الأسرة الكبرى المعروفة في الهيئة نادرة، وفي معظم الحالات، تستند إلى افتراضات نظرية بدلا ً من بيانات تجريبية. تطبيق الأساليب المذكورة هنا لأفراد الأسرة الفائقة من أجل الزراعة يعتمد على اهتمامات البحوث المحددة في علم الجراثيم. من ناحية أخرى، فإن المظاهرة الأخيرة التي مفادها أن أفراد الأسرة الفائقة في الهيئة العليا للأفراد الذين يلعبون أدوارا أساسية في مختلف المقصورات الخلوية (مثل السيتوسول مقابل الميتوكوندريا) تسلط الضوء على الحاجة إلى تحسين توصيف هذه البروتينات (ثلاثة منها كانت حددت حتى الآن)، على وجه الخصوص لأن البيانات الحالية تشير إلى أن بعض البروتينات غير مميزة قد تنفذ وظائف مختلفة في سياق البيولوجيا الميتوكوندريا، والبحوث الشيخوخة، وأبحاث السرطان. ومن المقترح أن التوصيف الجزيئي والفسيولوجي الكامل لهذه أفراد الأسرة الفائقة في فاه eukaryotic قد توفر نظرة ثاقبة هامة في المجالات الرئيسية للبحوث المعاصرة في قطاع الطب الحيوي. هناك حاجة إلى مزيد من البحث حول آليات FAHD1 (والإنزيمات ذات الصلة) لفهم أفضل للآليات الكامنة وراء ثنائية الوظائف من FAHD1، والتي لم يتم توضيحها بشكل كامل حتى الآن. وقد تساعد الدراسات الإضافية التي أجريت على المسوخ والتحقيقات في المثبطات ودراسات الهندسة والتركيب الهيكلي في حل السيناريوهات الآلية الحقيقية التي يبدو أن FAHD1 مختصة بها. وعلاوة على ذلك، فإن تصميم محاكاة enol بمساعدة الكمبيوتر قادرة على ربط عامل مساعد Mg سيؤدي في نهاية المطاف إلى مثبطات قوية من FAHD1.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون ممتنون جدا للمساعدة التقنية الخبراء من قبل أنابيلا بيتل وتطوير الأسلوب التجريبي من قبل هايمو بيرشر.
Materials
| BL21(DE3) pLysS competent E. coli | Promega | L1195 | High-efficiency protein expression from gene with T7 promoter and ribosome binding site |
| pET E. coli T7 Expression Vectors | MERCK | – | http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| 15 mL Falcon | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| PS Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro | VWR | 30622-758 | VIS transparent cuvettes |
| UV Cuvettes Spectrophotometer Semi-Micro | VWR | 47727-024 | UV/VIS transparent cuvettes |
| isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | ROTH | 2316 | chemical used for induction of protein expression with the DE3/pET system |
| imidazole | ROTH | X998 | chemical used for elution of polyhistidine (6xHis) sequences from a nickel-charged affinity resin |
| Glass Econo-Column Columns | Bio-Rad | – | http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&pcp_loc=catprod |
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic for bacterial growth selection; resistance endióded in pLysS plasmid of BL21(DE3) E. coli; 25 µg/mL final concentration |
| kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 50 µg/mL final concentration |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | antibiotic for bacterial growth selection; to be used if this resistance is encoded in the employed pET vector; 100 µg/mL final concentration |
| Ultra-15, MWCO 10 kDa | Sigma-Aldrich | Z706345 | centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de®ion=AT |
| Ultra-0.5 Centrifugal Filter Units | Sigma-Aldrich | Z677108 | centrifigal filters for protein enrichment; https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de®ion=AT&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2 |
| oxaloacetic acid | Sigma-Aldrich | O4126 | TCA metabolite |
| sodium oxlalate | Sigma-Aldrich | 71800 | a competitive inhibitor of FAH superfamily enzymes |
| Dialysis tubing cellulose membrane | Sigma-Aldrich | D9277 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277; or comparable |
| Ni-NTA agarose | Thermo-Fischer | R90101 | a nickel-charged affinity resin that can be used to purify recombinant proteins containing a polyhistidine (6xHis) sequence |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616 |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences | – | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| HiTrap Phenyl HP column | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630 |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723 |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608 |
| HiLoad Superdex column 75 pg (G75) | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800 |
| HiLoad Superdex column 200 pg (G200) | GE Healthcare Life Sciences | – | https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283 |
| TECAN microplate reader | TECAN Life Sciences | – | https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers |
| acetylpyruvate | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | – | custom synthesis |
| benzoylpyruvate | MoleculeCrafting.HuGs e.U. | – | custom synthesis |
| VDX™ plate (24 wells) | Hampton | HR3-142 | 24 well plates used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
| paraffin oil | Hampton | HR3-411 | used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
| coverslips (22 mm) | Karl Hecht KG | 14043 | coverslips used for crystallization via Hanging Drop Vapor Diffusion |
| Luria broth (LB) medium | self-prepared | – | a general growth medium for E. coli: 5 g/L yeast extract; 10 g/L peptone from casein; 10 g/L sodium chloride; 12 g/L agar-agar |
| NZCYM medium | self-prepared | – | a better growth medium for E. coli, used for amplification: 10 g/L NZ amine; 5 g/L NaCl; 5 g/L yeast extract; 1 g/L casamino acids; 2 g/L MgSO4; adjust pH to 7.4 |
| Luria broth (LB) agarose plates | self-prepared | – | autoclaved agarose plates containing LB-medium and antibiotics for bacterial groth selection; https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/ |
| Ni-NTA running buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 10-200 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
| Ni-NTA elution buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl pH 7,4; 50-300 mM NaCl; 200-500 mM imidazole; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
| HIC running buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 100 mM NaCl; 20 mM DTT; adjust to pH 7 |
| HIC running buffer AS | self-prepared | – | HIC running buffer saturated with ammonium sulfate (AS); adjust to pH 7: 70 g ammonium sulfate + 90 mL buffer, stirred overnight in the cold room; adjust to pH 7.0 |
| Mono S low salt buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 10-300 mM NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
| Mono S high salt buffer | self-prepared | – | 44 mM NaH2PO4; 6 mM Na2HPO4; 1-2 M NaCl; ranges: optimal value varies among FAHD proteins |
| Mono Q low salt buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl; 15 mM NaCl; adjust to pH 8.0 |
| Mono Q high salt buffer | self-prepared | – | 20 mM Tris-HCl; 1 M NaCl; 10 % glycerol; adjust to pH 8.0 |
| G75 / G200 running buffer | self-prepared | – | 15 mM Tris-HCl; 300 mM NaCl; adjust to pH 7.4 |
| enzyme assay buffer | self-prepared | – | 50 mM Tris-HCl pH7.4; 100 mM KCl; 1 mM MgCl2 |
| protein crystallization buffer | self-prepared | – | G75 / G200 running buffer with 1 mM DTT |
| reservoir solution for crystallization | self-prepared | – | 100 mM Na-HEPES pH 7.5; 5-20 % (w/v) PEG4k; 10 mM-200 mM MgCl2 |
References
- Brouns, S. J. J., et al. Structural Insight into Substrate Binding and Catalysis of a Novel 2-Keto-3-deoxy-d-arabinonate Dehydratase Illustrates Common Mechanistic Features of the FAH Superfamily. Journal of Molecular Biology. 379, 357-371 (2008).
- Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure (London, England: 1993). 7, 1023-1033 (1999).
- Weiss, A. K. H., Loeffler, J. R., Liedl, K. R., Gstach, H., Jansen-Dürr, P. The fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) superfamily of enzymes: multifunctional enzymes from microbes to mitochondria. Biochemical Society Transactions. 46, 295 (2018).
- Guimarães, S. L., et al. Crystal Structures of Apo and Liganded 4-Oxalocrotonate Decarboxylase Uncover a Structural Basis for the Metal-Assisted Decarboxylation of a Vinylogous β-Keto Acid. 生物化学. 55, 2632 (2016).
- Zhou, N. Y., Fuenmayor, S. L., Williams, P. A. nag genes of Ralstonia (formerly Pseudomonas) sp. strain U2 encoding enzymes for gentisate catabolism. Journal of Bacteriology. 183, 700 (2001).
- Izumi, A., et al. Structure and Mechanism of HpcG, a Hydratase in the Homoprotocatechuate Degradation Pathway of Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 370, 899-911 (2007).
- Manjasetty, B. A., et al. X-ray structure of fumarylacetoacetate hydrolase family member Homo sapiens FLJ36880. Biological Chemistry. 385, 935-942 (2004).
- Tame, J. R. H., Namba, K., Dodson, E. J., Roper, D. I. The crystal structure of HpcE, a bifunctional decarboxylase/isomerase with a multifunctional fold. 生物化学. 41, 2982-2989 (2002).
- Ran, T., et al. Crystal structures of Cg1458 reveal a catalytic lid domain and a common catalytic mechanism for the FAH family. The Biochemical Journal. 449, 51-60 (2013).
- Ran, T., Wang, Y., Xu, D., Wang, W. Expression, purification, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Cg1458: A novel oxaloacetate decarboxylase from Corynebacterium glutamicum. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 67, 968-970 (2011).
- Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286, 36500-36508 (2011).
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290, 6755-6762 (2015).
- Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
- Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475, 3561-3576 (2018).
- Taferner, A., et al. FAH domain-containing protein 1 (FAHD-1) Is required for mitochondrial function and locomotion activity in C. elegans. PLoS ONE. 10, 1-15 (2015).
- Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63, 792-794 (2007).
- Bateman, R. L., Bhanumoorthy, P., Witte, J. F., McClard, R. W., Grompe, M., Timm, D. E., et al. Mechanistic Inferences from the Crystal Structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a Bound Phosphorus-based Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276, 15284-15291 (2001).
- Zeng, F., et al. Efficient strategy for introducing large and multiple changes in plasmid DNA. Scientific Reports. 8, 1714 (2018).
- Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Research. 16, 7351-7367 (1988).
- Jansen-Duerr, P., Pircher, H., Weiss, A. K. H. The FAH Fold Meets the Krebs Cycle. Molecular Enzymology and Drug Targets. 2, 1-5 (2016).
- Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71, 247-260 (2015).
- Rupp, B. . Biomolecular Crystallography: Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).
- Flint, D. H., Nudelman, A., Calabrese, J. C., Gottlieb, H. E. Enol oxalacetic acid exists in the Z form in the crystalline state and in solution. The Journal of Organic Chemistry. 57, 7270-7274 (1992).
- Pogson, C. I. I., Wolfe, R. G. G. Oxaloacetic acid tautomeric and hydrated forms in solution. Biochemical and Biophysical Research Communications. 46, 1048-1054 (1972).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L., Kost, A. T. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
- Steinberger, R., Westheimer, F. H. Metal Ion-catalyzed Decarboxylation: A Model for an Enzyme System 1. Journal of the American Chemical Society. 73, 429-435 (1951).
- Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The stability constants of the magnesium complexes of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. , 1381-1389 (1964).
- Tate, S. S., Grzybowski, A. K., Datta, S. P. The acid dissociations of the keto and enol isomers of oxaloacetic acid at 25. Journal of Chemical Society. 1372, 1380 (1964).
- Brecker, L., et al. Synthesis of 2,4-diketoacids and their aqueous solution structures. New Journal of Chemistry. 23, 437-446 (1999).
