Descoberta natural do produto com filtração da fragmentação diagnóstica de LC-MS/MS: aplicação para a análise do Microcystin

A espectrometria de massas em tandem (MS/MS) é um método de espectrometria de massas amplamente utilizado que envolve isolar um íon precursor e induzir a fragmentação via aplicação da energia de ativação, como a dissociação induzida por colisão (CID)¹. A forma como os fragmentos de íons estão intimamente ligados à sua estrutura molecular. Os produtos naturais são muitas vezes biossintetizados como misturas de compostos estruturalmente semelhantes, em vez de como um único produto químico único². Como tal, compostos estruturalmente relacionados que fazem parte da mesma classe biossintética muitas vezes compartilham características-chave de fragmentação MS/MS, incluindo íons de produtos compartilhados e/ou perdas neutras. A capacidade de amostras complexas de tela para compostos que possuem íons de produto de classe específica e/ou perdas neutras é uma estratégia poderosa para detectar classes inteiras de compostos, potencialmente levando à descoberta de novos produtos naturais^{3, 4. º , 5. º , 6}. por décadas, os métodos de espectrometria de massa, como a digitalização de perda neutra e a digitalização de íons precursores realizados em instrumentos de baixa resolução permitiram a detecção de íons com a mesma perda neutra ou íons de produto. No entanto, os íons ou transições específicas precisavam ser definidos antes da realização dos experimentos. Como espectrómetros de massa de alta resolução tornaram-se mais populares em laboratórios de pesquisa, amostras complexas são agora comumente rastreadas usando métodos de aquisição (DDA) não direcionados e dependentes de dados. Em contraste com a perda neutra tradicional e a varredura do íon do precursor, os compostos estruturalmente relacionados podem ser identificados pela análise do borne-aquisição⁷. Neste trabalho, demonstramos uma estratégia que desenvolvemos denominado filtragem de fragmentação diagnóstica (dff)^5,6, uma abordagem direta e fácil de usar para detectar classes inteiras de compostos dentro de matrizes complexas. Este módulo DFF foi implementado na plataforma de código aberto, MZmine 2 e disponível baixando MZmine 2,38 ou lançamentos mais recentes. DFF permite aos usuários a tela eficientemente conjuntos de dados DDA para MS/MS espectros que contêm íons do produto (s) e/ou perda neutra (es) que são diagnósticos para classes inteiras de compostos. Uma limitação de DFF é íons do produto característico e/ou as perdas neutras para uma classe de compostos devem ser definidas pelo analista.

Por exemplo, cada uma das mais de 60 micotoxinas fumonisicas diferentes identificadas^8,9possuem uma cadeia lateral tricarballylic, que gera um íon de produto m/z 157, 142 (C₆H₅O₅^–) após fragmentação do [M-H]^– Ion⁴. Portanto, todas as fumonisinas putativas em uma amostra podem ser detectadas usando DFF por meio da triagem de todos os espectros MS/MS dentro de um conjunto de dados DDA que contenham o íon de produto m/z 157, 142 proeminente. Da mesma forma, os compostos sulados podem ser detectados pela triagem de conjuntos de dados DDA para espectros MS/MS que contêm uma perda neutra diagnóstica de 79,9574 da (SO₃)³. Esta abordagem também foi aplicada com sucesso para a detecção de novos peptídeos cíclicos⁵ e produtos naturais que contêm resíduos de triptofano ou fenilalanina⁶.

Para demonstrar a efetividade do DFF e sua facilidade de uso dentro da plataforma MZmine¹⁰, aplicamos essa abordagem à análise de microcistinas (MCS); uma classe de mais de 240 toxinas estruturalmente relacionadas produzidas por cianobactérias de água doce^11,12,13.

As cianotoxinas mais comumente relatadas são MCs, com o congéner MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) mais freqüentemente estudado (Figura 1). MCs são heptapeptides não-ribossômicos monocílicos, biossintetizados por múltiplos gêneros de cianobactérias, incluindo Microcystis, Anabaena, no, e Planktothrix^12,13. Os MCs são compostos por cinco resíduos comuns e duas posições variáveis ocupadas por aminoácidos L. Quase todos os MCs possuem um resíduo característico do ácido β-aminoácido 3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienoico (Adda) na posição 5¹¹.  As vias de fragmentação MS/MS do MCS são bem descritas^14,15; o resíduo de Adda é responsável para o íon proeminente do produto de MS/MS, m/z 135, 803⁺ (c₉H₁₁O⁺) assim como outros íons do produto que incluem m/z 163,1114⁺ (C₁₁H₁₅ O⁺) (Figura 2). Conjuntos de dados de DDA não direcionados de extratos celulares de Microcystis aeruginosa podem ser rastreados para todas as microcistinas presentes usando esses íons diagnósticos, dado que as microcistinas têm um resíduo de Adda.