Registrazione ottica a singolo fotone a campo largo nelle sezioni cerebrali utilizzando Colorazione sensibile alla tensione
Summary
Introduciamo un metodo di registrazione ottica riproducibile e stabile per le fette cerebrali usando coloranti sensibili alla tensione. L’articolo descrive la colorazione sensibile alla tensione e la registrazione di segnali ottici utilizzando preparazioni convenzionali di fette ippocampali.
Abstract
L’imaging a singolo contenuto fotonico sensibile alla tensione (VSD) a singolo campo dei preparati delle fette cerebrali è uno strumento utile per valutare la connettività funzionale nei circuiti neurali. A causa del cambiamento frazionario nel segnale luminoso, è stato difficile utilizzare questo metodo come analisi quantitativa. Questo articolo descrive speciali sistemi di ottica e gestione delle fette, che rendono questa tecnica stabile e affidabile. Il presente articolo illustra in dettaglio la gestione, la colorazione e la registrazione delle fette di ippocampale macchiate di VSD. Il sistema mantiene le condizioni fisiologiche per lungo tempo, con una buona colorazione, e previene i movimenti meccanici della fetta durante le registrazioni. Inoltre, consente la colorazione delle fette con una piccola quantità di colorante. L’ottica raggiunge un’apertura numerica elevata a basso ingrandimento, che consente la registrazione del segnale VSD alla frequenza fotogrammi massima di 10 kHz, con una risoluzione spaziale di 100 x 100 pixel. A causa dell’elevata frequenza fotogrammi e della risoluzione spaziale, questa tecnica consente l’applicazione dei filtri di post-registrazione che forniscono un rapporto segnale-rumore sufficiente per valutare i cambiamenti nei circuiti neurali.
Introduction
L’imaging a singolo campo fotonico sensibile alla tensione (VSD) di preparazioni di fette cerebrali macchiate di massa è diventato un utile strumento quantitativo per valutare la dinamica dei circuiti neurali1,2,3,4 . Dopo l’analisi dei cambiamenti nelle proprietà ottiche dovute all’eccitazione della membrana5,6,7, l’imaging VSD è stato descritto per la prima volta nei primi anni ’70 da Cohen e altri6,8, 9. è un metodo adatto per monitorare le funzioni cerebrali in tempo reale in quanto il colorante sonda direttamente i potenziali cambiamenti della membrana (cioè, il segnale primario dei neuroni).
I primi VSD possedevano le caratteristiche desiderabili per comprendere il sistema cerebrale, come una costante temporale veloce per seguire la rapida cinetica degli eventi potenziali della membrana neuronale e la linearità con il cambiamento nel potenziale della membrana9, 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12 mila , 13 del sistema , 14 Del sistema , 15. Simile ad altri esperimenti di imaging, questa tecnica richiede una vasta gamma di accordature specifiche, come le telecamere, l’ottica, il software e la fisiologia delle fette, per ottenere i risultati desiderati. A causa di queste insidie tecniche, i benefici attesi durante gli sforzi iniziali non si sono necessariamente concretizzati per la maggior parte dei laboratori che non si sono specializzati in questa tecnica.
La causa primordiale della difficoltà tecnica era la bassa sensibilità del VSD verso il potenziale cambiamento della membrana quando applicato alla colorazione alla rinfusa dei preparati della fetta. La grandezza del segnale ottico (cioè il cambiamento frazionario della fluorescenza) è di solito 10-4-10-3 del segnale di controllo (F0) in condizioni fisiologiche. La scala temporale del potenziale cambiamento della membrana in un neurone è di circa millisecondi a poche centinaia di millisecondi. Per misurare i cambiamenti nel potenziale di membrana del neurone, la fotocamera utilizzata per la registrazione dovrebbe essere in grado di acquisire immagini ad alta velocità (da 10 kHz a 100 Hz). La bassa sensibilità di VSD e la velocità necessaria per seguire il segnale neurale richiede una grande quantità di luce da raccogliere alla fotocamera ad alta velocità, con un alto rapporto segnale-rumore (S/N)2,16.
L’ottica del sistema di registrazione è anche un elemento critico per garantire la raccolta di luce sufficiente e migliorare S/N. L’ingrandimento ottenuto dall’ottica è spesso eccessivamente basso, come 1X a 10X, per visualizzare un circuito neurale funzionale locale. Ad esempio, per visualizzare la dinamica del circuito ippocampale, sarebbe adatto un ingrandimento di circa 5. Tale basso ingrandimento ha bassa efficienza di fluorescenza; pertanto, l’ottica avanzata sarebbe vantaggiosa per tale registrazione.
Inoltre, la fisiologia della fetta è anche essenziale. Poiché l’analisi di imaging richiede che le fette siano intatte, è necessaria un’attenta manipolazione delle fette17. Inoltre, le misure adottate per mantenere la vitalità della fetta per un tempo più lungo sono importanti18.
Il presente descrive il protocollo per la preparazione di sezioni, colorazione VSD e misure. L’articolo descrive anche i miglioramenti apportati ai VSD, al dispositivo di imaging e all’ottica e altri miglioramenti aggiuntivi al sistema sperimentale che hanno permesso di utilizzare questo metodo come un saggio semplice, potente e quantitativo per visualizzare il modifica delle funzioni cerebrali19,20,21,22,23,24,25. La tecnica può anche essere ampiamente utilizzata per il potenziamento a lungo termine nell’area CA1 di fette ippocampali1. Inoltre, questa tecnica è utile anche nella registrazione ottica dei potenziali della membrana in una singola cellula nervosa26.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fisiologia della fetta è fondamentale per raccogliere il segnale giusto. L’uso del sistema di filtro ad anello-membrana in questo protocollo assicura chela fetta rimanga sana e non distorta durante tutta la procedura 2,16,17. Altri sistemi possono essere utilizzati per mantenere la fisiologia della fetta durante la registrazione, ma la fetta non dovrebbe deformarsi in qualsiasi momento in quanto l’imaging ha bisogno di ogni …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TT ha ricevuto il JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 e JP15K00413) di MEXT e sovvenzioni del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] e H30 [18062156]). Ringraziamo Editage (www.editage.jp) per l’editing in lingua inglese.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
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