Applicazione dell'interferometria biostrato (BLI) per lo studio delle interazioni tra proteine e proteine nella trascrizione

La trascrizione, che produce molecole di RNA usando il DNA come modello, è il primo passo dell’espressione genica. La sintesi dell’RNA batterica inizia dopo il legame dell’ologassi dell’RNA polimerasi (RNAP) a un promotore bersaglio^1,2. L’oloenzima RNAP (RNAPholo) è costituito da un nucleo catalitico multi-subunità (RNAPcore) e da un fattore di z, che è necessario per riconoscere la sequenza promotrice. Attivatori di trascrizione e repressori, collettivamente ritiditi TF, regolano l’espressione genica attraverso i componenti di legame dell’RNAPcore, dei fattori e/o del DNA. A seconda dell’organismo, una parte significativa del suo genoma può essere dedicata ai TF che regolano la trascrizione in risposta a i bisogni fisiologici e i segnali ambientali³.

La clamidia è un batterio intracellulare obbligato responsabile di una varietà di malattie nell’uomo e negli animali^4,5,6,7,8. Ad esempio, la clamidia transatide è probabilmente il numero uno patogeno sessualmente trasmissibile negli esseri umani in tutto il mondo, e una delle principali cause di cecità in alcuni paesi sottosviluppati^4,5. La clamidia ha un ciclo di sviluppo unico caratterizzato da due forme cellulari alternate definite corpo elementare (EB) e corpo reticolato (RB)⁹. Mentre, EBs sono in grado di sopravvivenza in un ambiente extracellulare, sono incapaci di proliferazione. Gli EB entrano nelle cellule ospiti attraverso l’endocitosi e si differenziano in MB più grandi in un vacuolo nel citoplasma ospite entro ore dopo l’inoculazione. Non più infettivi, gli MB proliferano attraverso la fissione binaria. Circa 20 h, iniziano a differenziarsi di nuovo agli EB, che escono dalle celle ospiti intorno a 30-70 h.

La progressione del ciclo di sviluppo della clamidia è regolata dalla trascrizione. Mentre una supermaggioranza dei quasi 1.000 geni clamidici è espressa durante il ciclo intermedio durante il quale gli RB si stanno replicando attivamente, solo un piccolo numero di geni viene trascritto immediatamente dopo l’ingresso di EB nelle cellule ospiti per avviare la conversione di Gli EB in MB e un altro piccolo insieme di geni sono trascritti o sempre più trascritti per consentire la differenziazione degli MB in EB^10,11.

Il genoma clamidiale codifica tre fattori, vale a dire⁶⁶,²⁸ e⁵⁴. ⁶⁶, che è equivalente alla pulizia di 70 e altri batteri, è responsabile del riconoscimento dei promotori di geni precoci e a metà ciclo, nonché di alcuni geni in ritardo, mentre sono necessari²⁸ e ⁵⁴ la trascrizione di alcuni geni tardivi. Sono noti che diversi geni trasportano sia un promotore dipendente da⁶⁶usd che un promotore dipendente da^{28USD 12}.

Nonostante un ciclo di sviluppo complicato, solo un piccolo numero di TF sono stati trovati in clamidiae¹³. GrgA (precedentemente annotato come una proteina ipotetica CT504 in C. trachomatis serovar D e CTL0766 in C. trachomatis L2) è un TF specifico di Chlamydiainizialmente riconosciuto come un attivatore di geni dipendenti da^66. I saggi di tracciamento dell’affinità hanno dimostrato che GrgA attiva la loro trascrizione legando sia il DNA di⁶⁶ che quello del DNA. È interessante notare che, in seguito è stato trovato con che GrgA co-precipita anche con²⁸, e attiva la trascrizione da^{28-dipendenti}promotori in vitro¹⁵. Per verificare se GrgA ha affinità simili o diverse per i valori⁶⁶ e²⁸, abbiamo fatto ricorso all’utilizzo di BLI. I saggi BLI hanno dimostrato che il GrgA interagisce con 66 volte con un’affinità 30 volte superiore rispetto a quella di²⁸, suggerendo che GrgA può svolgere ruoli differenziali nella trascrizione dipendente da⁶⁶USD e nella trascrizione dipendente da^{28 15}.

BLI rileva il modello di interferenza della luce bianca che si riflette da uno strato di proteine immobilizzate sulla punta di un biosensore e lo confronta con quello di un livello di riferimento interno¹⁶. Attraverso l’analisi di questi due modelli di interferenza, BLI può fornire informazioni preziose e in tempo reale sulla quantità di proteine legate alla punta del biosensore. La proteina che viene immobilizzata sulla punta del biosensore è chiamata ligando, ed è generalmente immobilizzata con l’aiuto di un anticorpo comune o di un tag epitopo (ad esempio, un poli-His- o biotin-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotina-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotina-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un’affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un Streptavidin) sulla punta del biosensore. Il legame di una proteina secondaria, indicato come analita, con il ligando sulla punta del biosensore crea cambiamenti nell’opacità del biosensore e quindi si traduce in cambiamenti nei modelli di interferenza. Quando si ripete su diverse concentrazioni dell’analita, BLI può fornire non solo informazioni qualitative ma anche quantitative sull’affinità tra il ligando e l’analita¹⁶.

Per quanto ne sappiamo, siamo stati i primi ad impiegare BLI per caratterizzare le interazioni proteina-proteina nella trascrizione¹⁵. In questa pubblicazione, dimostriamo che un frammento di GrgA, che in precedenza è stato dimostrato essere necessario per l’associazione^28,media effettivamente l’associazione. Questo manoscritto si concentra sui passi dei saggi BLI e sulla generazione di grafici BLI e parametri di cinetica legante. I metodi per la produzione (e la purificazione) di ligandi e analiti non sono coperti qui.