Summary

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

Published: July 26, 2019
doi:

Summary

Взаимодействие транскрипционных факторов (TFs) с РНК-полимеразой обычно изучается с помощью анализов свау. Мы применяем технологию биослойной интерферометрии (BLI) для характеристики взаимодействия GrgA с хламидиальной РНК-полимеразой. По сравнению с анализами стягивания, BLI обнаруживает ассоциацию и диссоциацию в реальном времени, обеспечивает более высокую чувствительность и является высокой количественной.

Abstract

Фактор транскрипции (TF) является белок, который регулирует экспрессию генов, взаимодействуя с РНК-полимераза, другой TF, и / или шаблон ДНК. GrgA является новым активатором транскрипции, найденным специально в облике внутриклеточного бактериального патогена Хламидиоз. Белковые анализы с использованием бисера сродства показали, что GrgA связывает два фактора, а именно:66 и28,которые распознают различные наборы промоутеров для генов, продукты которых по-разному необходимы на стадиях развития. Мы использовали BLI для подтверждения и дальнейшей характеристики взаимодействий. BLI демонстрирует несколько преимуществ по сравнению с выдвижной: 1) Он показывает в режиме реального времени ассоциации и диссоциации между обязательными партнерами, 2) Он генерирует количественные кинетические параметры, и 3) Он может обнаружить привязки, что выдвижной анализы часто не обнаруживаются. Эти характеристики позволили нам вывести физиологические роли GrgA в регуляции экспрессии генов в хламидиозе,и возможные подробные механизмы взаимодействия. Мы представляем, что эта относительно доступная технология может быть чрезвычайно полезна для изучения транскрипции и других биологических процессов.

Introduction

Транскрипция, которая производит молекулы РНК с использованием ДНК в качестве шаблона, является самым первым шагом экспрессии генов. Бактериальный синтез РНК начинается после связывания РНК-полимераза(RNAP) голефермента к целевому промоутеру 1,2. Голензим RNAP (RNAPholo) состоит из многосубунитая каталитического ядра (РНАПкор) и коэффициента, который необходим для распознавания последовательности промотора. Активаторы и репрессоры транскрипции, которые в совокупности называются TFs, регулируют экспрессию генов через связывающие компоненты РНАПКОР, факторы и/или ДНК. В зависимости от организма, значительная часть его генома может быть посвящена TFs, которые регулируют транскрипцию в ответ на физиологические потребности и экологические сигналы3.

Хламидиоз является обликовой внутриклеточной бактерией, ответственной заразличные заболевания у людей и животных 4,5,6,7. Например, Chlamydia trachomatis, возможно, номер один венерических патогенов в организме человека во всем мире, и ведущей причиной слепоты в некоторых слаборазвитых странах4,5. Хламидиоз имеет уникальный цикл развития, характеризующийся двумя чередующимися клеточными формами, терминированными элементарным телом (EB) и ретикулированным телом (RB)9. В то время как ЭБ способны выжить во внеклеточной среде, они неспособны к распространению. EBs ввести клетки хозяина через эндоцитоз и дифференцировать в более большие RBs в vacuole в цитоплазме хозяина в течение нескольких часов после прививки. Больше не заразны, RBs размножаться через двоичные деления. Около 20 ч, они начинают дифференцировать обратно к EBs, которые выходят из клеток-хозяев около 30-70 ч.

Прогрессирование цикла развития хламидийного регулируется транскрипцией. В то время как супербольшинство из почти 1000 генов хламидийных выражены во время среднего цикла, во время которого РБ активно реплицируются, только небольшое количество генов транскрибируются сразу после вступления EBs в клетки-хозяина, чтобы инициировать преобразование EBs в RBs, и другой небольшой набор генов транскрибируются или все чаще транскрибируются, чтобы дифференциация РБ в EBs10,11.

Геном хламидийного кода кодирует три фактора, а именно:66,28 и54. 66 , что эквивалентно ведению домашнего хозяйстваNo 70 кишечной палочки и других бактерий, отвечает за распознавание промоторов генов раннего и среднего цикла, а также некоторых поздних генов, в то время как для распознавания генов раннего и среднего цикла требуется28 и54 евро транскрипция некоторых поздних генов. Несколько генов, какизвестно, несут как No 66-зависимых промоутер и No 28-зависимых промоутер12.

Несмотря на сложный цикл развития, лишь небольшое количество TFs были найдены в хламидиоза13. GrgA (ранее аннотированный как гипотетический белок CT504 в C. trachomatis serovar D и CTL0766 в C. trachomatis L2) является Chlamydia-специфическимTF, первоначально признанным активатором генов No 66-зависимых14. Аффинити вытягивания анализы показали, что GrgA активирует их транскрипции, связывая какNo 66 и ДНК. Интересно, что позже было найдено с тем, что GrgA также совместно осаждает с28, и активирует транскрипцию от 28-зависимых промоутеров in vitro15. Чтобы исследовать, имеет ли GrgA сходные или различные сходства дляNo 66 иNo 28,мы прибегли к использованию BLI. BLI анализы показали, что GrgA взаимодействует сNo 66 в 30-кратном более высоком сродстве, чем с28,предполагая, что GrgA может играть дифференцированные роли в 66-зависимой транскрипции и28-зависимойтранскрипции 15.

BLI обнаруживает интерференционную модель белого света, которая отражается от слоя обездвиженого белка на кончике биосенсора, и сравнивает его с внутренним эталонным слоем16. Благодаря анализу этих двух интерференционных моделей, BLI может предоставить ценную и в режиме реального времени информацию о количестве белка, привязанного к кончику биосенсора. Белок, который обездвижен к кончику биосенсора, называется лигандом и, как правило, обездвижен с помощью общего антитела или эпитопа (например, поли-Его- или биотин-тег), который имеет сродство к ассоциированной частицы (например, NTA или Стрептавидин) на кончике биосенсора. Связывание вторичного белка, называемого анализным, с лигандой на кончике биосенсора создает изменения в непрозрачности биосенсора и, следовательно, приводит к изменениям в интерференционных моделях. При повторении в течение различных концентраций аналита, BLI может предоставить не только качественную, но и количественную информацию о сродстве между лигандом и аналитом16.

Насколько нам известно, мы были первыми, кто использовал BLI для характеристики белково-белковых взаимодействий в транскрипции15. В этой публикации мы демонстрируем, что фрагмент GrgA,который ранее был показан как необходимый для 28-связной, действительно опосредует привязку. Данная рукопись посвящена шагам анализов BLI, а также генерации графиков BLI и параметров связывающей кинетики. Методы производства (и очистки) лигандов и аналитов здесь не охватываются.

Protocol

1. Подготовка белков Используйте диализный мешок (с соответствующим размером отсечения) для диализа каждого белка, который будет использоваться для анализов BLI (включая лиганд с его тегами и анализ) против 1000 томов буфера BLI (25 мм Tris-HCl, 150 мм NaCl, 0,1 мМ EDTA, 10 мм 2Cl , 0,1 мм DTT, pH 8.0, предв?…

Representative Results

Через BLI анализы, мы ранее установили, что связывание GrgA доNo 28 зависит от 28 аминокислот среднего региона (остатки 138-165) GrgA15. Соответственно, по сравнению с N-терминально Его помечены полной длины GrgA (NH-GrgA), GrgA удаления конструкции не хватает этого региона (NH-GrgA-138-165) было сн…

Discussion

Белково-белковые взаимодействия имеют решающее значение для регуляции транскрипции и других биологических процессов. Они наиболее часто изучаются с помощью анализов свайпов. Хотя анализы вытягивания относительно легки для выполнения, они плохо количественные и могут не обнаружить с…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (Гранты AI122034 и AI140167) и Фондом здравоохранения Нью-Джерси (Грант 20-18).

Materials

BLItz machine ForteBio 45-5000
Dialysis tubing cellulose membrane MilliporeSigma D9652
Dip and Read Ni-NTA biosensor tray ForteBio 18-5101 Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins
Drop holder ForteBio 45-5004
PCR tubes (0.2 mL) Thomas Scientific CLS6571
Microcentrifuge tubes (black) Thermo Fisher Scientific 03-391-166
Kimwipes Thermo Fisher Scientific 06-666A
DTT Thermo Fisher Scientific R0861
EDTA MilliporeSigma E6758
MgCl2 MilliporeSigma M8266
NaCl MilliporeSigma S9888
Tris-HCl GoldBio T095100

References

  1. Vvedenskaya, I. O., et al. Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).
  2. Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective. Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).
  3. Visweswariah, S. S., Busby, S. J. Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones. Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).
  4. Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. Trachoma. Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).
  5. WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).
  6. Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children. The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).
  7. De Puysseleyr, K., et al. Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse. BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).
  8. Hulin, V., et al. Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry. Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).
  9. Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. Chlamydia. Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).
  10. Belland, R. J., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).
  11. Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).
  12. Tan, M., Tan, M., Bavoil , P. M. . Intracellular pathogens I: Chlamydiales. , 149-169 (2012).
  13. Domman, D., Horn, M. Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation. Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).
  14. Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).
  15. Desai, M., et al. Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis. Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).
  16. Joy, C., et al. Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  17. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).
  18. Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA). Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).
  19. Nelson, R. W., Krone, J. R. Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).
  20. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics. Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).
  21. Visentin, J., et al. Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance. Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).
  22. Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers. ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).
  23. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).
  24. Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications. Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175 (2016).
  25. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383 (2014).
  26. Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).

Play Video

Cite This Article
Desai, M., Di, R., Fan, H. Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription. J. Vis. Exp. (149), e59687, doi:10.3791/59687 (2019).

View Video