Este estudo introduz e descreve protocolos para derivar dois organóides neurais humanos específicos como um modelo relevante e exato para estudar 1) desenvolvimento humano do glioblastoma dentro dos organóides neural humanos exclusivamente nos seres humanos e 2) neurônio dopaminérgicos diferenciação, gerando um organoide tridimensional.
A falta de modelos neurais in vitro relevantes é um importante obstáculo ao progresso médico para as neuropatologias. O estabelecimento de modelos celulares relevantes é crucial para melhor compreender os mecanismos patológicos dessas doenças e identificar novos alvos e estratégias terapêuticas. Para ser pertinente, um modelo in vitro deve reproduzir as características patológicas de uma doença humana. Entretanto, no contexto da doença neurodegenerativas, um modelo in vitro relevante deve fornecer a recolocação da pilha neural como uma oportunidade terapêutica valiosa.
Tal modelo permitiria não somente a seleção de moléculas terapêuticas mas igualmente pode ser usado para aperfeiçoar a diferenciação neural do protocolo [por exemplo, no contexto da transplantação na doença de Parkinson (paládio)]. Este estudo descreve dois protocolos in vitro de 1) desenvolvimento humano do glioblastoma dentro de um organóides neural humano (no) e de 2) diferenciação dopaminérgicos (da) do neurônio que gera um organoid tridimensional (3D). Para tanto, estabeleceu-se um protocolo bem padronizado que permite a produção de neuroesferas calibradas por tamanho derivadas da diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESC). O primeiro modelo pode ser usado para revelar os eventos moleculars e celulares que ocorrem durante no desenvolvimento do glioblastoma dentro do organoid neural, quando o organoid DA DA representar não somente uma fonte apropriada de neurônios DA DA para a terapia da pilha na doença de Parkinson mas igualmente pode ser usado para testes de drogas.
A Organização Mundial da saúde (OMS) classifica os astrocitomas como grau baixo (grau I a II) ou alto grau (grau III e IV). Glioblastoma multiforme (GBM) é um astrocitoma grau IV, o mais letal dos tumores cerebrais primários, que é resistente a todas as formas atuais de tratamentos1. Apesar da terapia do padrão–cuidado que inclui a neurocirurgia, a quimioterapia, e a radioterapia, GBM permanece fatal e a taxa de sobrevivência total de 15 meses não mudou dramàtica sobre os 15 anos passados2. Para fazer progressos significativos na compreensão da patogênese da GBM, o uso de modelos relevantes é fundamental. Até o momento, o estudo da GBM baseou-se em linhagens celulares, fatias organootípicas de roedores e xenotransplante de células derivadas de pacientes em camundongos ou camundongos transgênicos desenvolvendo tumores espontâneos3,4. Embora esses modelos tenham sido úteis para estudar a metástase cerebral e a agressividade tumoral, eles são restritos por diferenças entre as espécies, e as conclusões resultantes podem ser traduzidas incorretamente para os tecidos humanos. Além disso, os modelos existentes com células humanas também são limitados pela ausência de interações tecido/tumor do hospedeiro3,4. Os modelos experimentais são críticos para a tradução da ciência básica para alvos terapêuticos. Portanto, descrever um protocolo para produzir organóides neurais humanos in vitro cocultivados com células iniciadores de GBM (GICs) pode fornecer um sistema relevante que imita características morfológicas e funcionais do desenvolvimento da GBM. Este sistema reproduz algumas características in vivo de desenvolvimentosgbm como migração difusa de células invasoras e áreas de necrose, e destaca a expressão gênica relevante para a biologia tumoral. Como revelado anteriormente, alguns microRNAs críticos são induzidos durante o desenvolvimento do GIC dentro do tecido nervoso 3D5,6.
O PD é uma desordem neurodegenerativas principal e associado com a degeneração de subtipos neuronal múltiplos7. Mesmo que um início progressivo dos sintomas (por exemplo, bradicinesia, tremor assimétrico do descanso, rigidez e instabilidade da postura) caracterize a doença, sua etiologia exata não é estabelecida claramente. Na verdade, muitos estudos têm destacado evidências de que os principais fatores de risco podem resultar de uma combinação de fatores genéticos e ambientais. Os sintomas de parkinsonianos estão associados à degeneração bilateral dos neurônios dopaminérgicos na substancia nigra (SN), levando ao desaparecimento de axônios dopaminérgicos (da) projetando-se para o estriado8,9. Portanto, a redução dos níveis de dopamina estriatal está correlacionada com a progressão da disfunção motora em pacientes com DP. Os neurônios dopaminérgicos contêm Tirosina Hidroxilase (TH), uma enzima chave na síntese de neurotransmissores catecolaminérgicos que converte o aminoácido L-tirosina para L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA, um precursor de dopamina) para dopamina10. A perda adiantada da atividade do TH seguiu por um declínio na expressão da proteína do TH é uma indicação do paládio.
Este estudo descreve dois protocolos usando organoids neurais humanos, com um orientado especificamente para um midbrain-como o phenotype enriquecido com as pilhas do TH-positive.
Um dos aspectos mais críticos deste protocolo inclui a manutenção da pluripotência de hESC durante a cultura da célula e o monitoramento estreito das esferas e da morfologia organoide neural. os hESCs são muito sensíveis, e cada manipulação pode conduzir à diferenciação descontrolada adiantada assim como a morte da pilha. A fim aumentar a reprodutibilidade experimental e evitar a ocorrência de eventos anormais do karyotype, recomenda-se para criopreservar diversos lotes dos hESCs na passagem a mais baixa após a validação de sua estabilidade do cromossoma. Além disso, recomenda-se descongelar um novo frasco para cada experimento e verificar o comportamento das células todos os dias. Se as esferas são menos refração com tamanho mais alto anormal, eles provavelmente começará a agregar e morrer.
Uma melhoria em cima deste sistema é a perfusão ou a implementação de um sistema vascularized (adicionando pilhas endothelial ou dentro de um microchip fluídico 3D)12,13. Entretanto, controlar a espessura do organoid neural (≤ 300 μm) permite a perfusão passiva eficiente do oxigênio e dos nutrimentos e impede a necrose. Outra melhoria é a introdução de células imunes (microglia). Com estas limitações na mente, os organóides neural mais um sistema de GIC podem ser uma ferramenta relevante para diversas razões. Em primeiro lugar, este sistema permite a triagem de drogas para monitorar como um composto terapêutico pode afetar uma célula organoide ou tumor. Segundo, as interações célula a célula podem ser estudadas, e os determinantes microambientais subjacentes às invasões individuais e coletivas podem ser visualizados e explorados5,6,13.
No contexto da doença de Parkinson, um organóide neural enriquecido em neurônios DA DA pode representar um modelo 3D relevante e preciso para estudar o desenvolvimento DA doença. Em estudos prévios, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo paciente de Parkinson diferenciadas para os neurônios DA DA foram usadas para estudar os subtipos neuronais afetados. De notar, alguns fenótipos relacionados à doença, como o acúmulo de α-sinucleina e sensibilidade ao estresse oxidativo,foram observados14,15. Além disso, o organóide neural pode ser usado como uma ferramenta para a tela de moléculas terapêuticas. No entanto, leituras específicos e relevantes devem ser configurados para avaliar a sobrevida e a funcionalidade do neurônio da da, como a produção de dopamina e a atividade eletrofisiológica. Ao todo, este protocolo fornece duas abordagens padronizadas e precisas baseadas em células-tronco para gerar organóides neurais.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem à ligue Genevoise contre le Cancer (Genebra, Suíça), à Fundação ISREC (Lausanne, Suíça) e à Fundação Clayton de pesquisa (Houston, TX, EUA) pelo apoio financeiro. Além disso, os autores agradecem ao HES-HO e ao Wyss Center pelo apoio financeiro. Agradecemos ao laboratório de Krause por discussões e apoio úteis e Dr. Halah Kutaish para revisão.
6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |