التحقيقات الكهرولوجية من وظائف المشبك وCorticogeniculate
Summary
هنا، نقدم بروتوكولات لإعداد شرائح الدماغ الحادة التي تحتوي على النواة الجينوسيلات الجانبية والتحقيق الكهرولوجيولوجي لوظيفة نقاط الاشتباك العصبي وcortinogeniculate. يوفر هذا البروتوكول طريقة فعالة لدراسة نقاط الاشتباك العصبي مع احتمال الإفراج العالي والإفراج المنخفض في نفس شرائح الدماغ الحادة.
Abstract
النواة الجانبية هي أول محطة ترحيل للمعلومات البصرية. الخلايا العصبية ترحيل هذه النواة الثلاميك دمج المدخلات من خلايا العقدة الشبكية والمشروع إلى القشرة البصرية. وبالإضافة إلى ذلك، تتلقى الخلايا العصبية التتابع الإثارة من أعلى إلى أسفل من القشرة. يختلف المدخلات المحفزة الرئيسية اثنين إلى الخلايا العصبية التتابع في عدة جوانب. تتلقى كل خلية عصبية ترحيل المدخلات من عدد قليل فقط من نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate، والتي هي محطات كبيرة مع العديد من مواقع الافراج. وينعكس هذا من الإثارة قوية نسبيا، والخلايا العصبية التتابع تلقي، من خلايا العقدة الشبكية. وعلى النقيض من ذلك، فإن نقاط الاشتباك العصبي الكورسية المثلى هي أبسط مع عدد قليل من مواقع الإطلاق وقوة متشابكة أضعف. كما يختلف الاشتباك ان اثنين من المشابك في اللدونة على المدى القصير متشابك. المشابك retinogeniculate لديها احتمال الإفراج عالية وبالتالي عرض الاكتئاب على المدى القصير. وعلى النقيض من ذلك، فإن نقاط الاشتباك العصبي الكورتيكولوكية لها احتمال إطلاق منخفض. تجتاز الألياف الكورتيكجينية الشبكية النوى الثالية الشبكية قبل دخول النواة الميكنولية الجانبية. تسمح المواقع المختلفة لنواة الثالاني الشبكية (الرترالي من النواة الجينوسيلات الجانبية) والمسالك البصرية (فينترو-أفقياً من النواة الميكنيوليت الجانبية) بتحفيز نقاط الاشتباك العصبي الكورتيكانوجينية أو الشبكية على حدة مع أقطاب التحفيز خارج الخلية. وهذا يجعل النواة الجينية الجانبية منطقة الدماغ مثالية حيث اثنين من نقاط الاشتباك العصبي المحفزة مع خصائص مختلفة جدا ً التي تُسطّل على نفس نوع الخلية، يمكن دراستها في وقت واحد. هنا، ونحن نصف طريقة للتحقيق في تسجيل من الخلايا العصبية التتابع وإجراء تحليل مفصل لوظيفة متشابك retinogeniculate وcorticogeniculate في شرائح الدماغ الحادة. تحتوي هذه المقالة على بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد شرائح الدماغ الحادة من النواة جينيولات الجانبية وخطوات لتسجيل النشاط من الخلايا العصبية التتابع عن طريق تحفيز الجهاز البصري والألياف corticogeniculate بشكل منفصل.
Introduction
الخلايا العصبية ترحيل من النواة جينيولات الجانبية دمج ونقل المعلومات البصرية إلى القشرة البصرية. تتلقى هذه الخلايا العصبية مدخلات محفزة من الخلايا العقدية عن طريق نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate، والتي توفر محرك الأقراص المحفزالرئيسي للخلايا العصبية التتابع. وبالإضافة إلى ذلك، تتلقى الخلايا العصبية التتابع المدخلات المحفزة من الخلايا العصبية القشرية عن طريق نقاط الاشتباك العصبي corticogeniculate. وعلاوة على ذلك، تتلقى الخلايا العصبية التتابع المدخلات المثبطة من الخلايا العصبية المحلية والخلايا العصبية GABAergic من النواة reticularis thalami1. النواة reticularis الثالامي موجود ة مثل درع بين المهاد والقشرة بحيث الألياف إسقاط من القشرة إلى المهاد وفي الاتجاه المعاكس يجب أن تذهب من خلال نواة reticularis الثالامي2.
المدخلات retinogeniculate والمدخلات corticogeniculate عرض خصائصمتشابك متميزة 3،4،5،6،7،8. المدخلات Retinogeniculate تشكل محطات كبيرة مع مواقع إطلاق متعددة9،10. وعلى النقيض من ذلك، تعرض المدخلات corticogeniculate محطات صغيرة مع مواقع إطلاق واحدة7. وبالإضافة إلى ذلك، فإن نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate تدفع بكفاءة إمكانات العمل من الخلايا العصبية التتابع على الرغم من أنها تشكل فقط 5-10٪ من جميع نقاط الاشتباك العصبي على الخلايا العصبية التتابع3،8،11. من ناحية أخرى، تعمل نقاط الاشتباك العصبي Corticogeniculate، كمغير لانتقالات retinogeniculate من خلال التحكم في إمكانات الغشاء من الخلايا العصبية التتابع12،13.
هذه المدخلات المحفزة الرئيسية اثنين لترحيل الخلايا العصبية هي أيضا مختلفة وظيفيا. أحد الاختلافات البارزة هو الاكتئاب على المدى القصير من نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate وتسهيل قصيرة الأجل من نقاط الاشتباك العصبي corticogeniculate3،5،8. اللدونة على المدى القصير يشير إلى ظاهرة التي تتغير قوة متشابك عندما يكون متشابك نشطة مرارا وتكرارا في غضون فترة زمنية من بضعة مللي ثانية إلى عدة ثوان. احتمال إطلاق متشابك هو عامل مهم الكامنة وراء اللدونة على المدى القصير. وتبدي نقاط الاشتباك العصبي، مع احتمال إطلاق أولي منخفض، تيسيراً قصير الأجل بسبب تراكم Ca2+ في الpresynapse، وبالتالي لوحظ حدوث زيادة في احتمال الإطلاق عند تكرار النشاط. وعلى النقيض من ذلك، فإن نقاط الاشتباك العصبي ذات الاحتمال العالي للإطلاق عادة ما تظهر الاكتئاب على المدى القصير بسبب استنفاد الحويصلات الجاهزة14. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إزالة الحساسية من مستقبلات المشاركات يساهم في اللدونة على المدى القصير في بعض نقاط الاشتباك العصبي احتمال الإفراج العالي8،15. ارتفاع احتمال الإطلاق وإزالة الحساسية من α-أمينو-3-هيدروكسي-5-ميثيل-4-إيسوكسازولبروبيونيك حمض (AMPA) مستقبلات تسهم في الاكتئاب على المدى القصير بارزة من نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate. وعلى النقيض من ذلك، فإن احتمال الإطلاق المنخفض يكمن وراء التيسير القصير الأجل لنقاط الاشتباك العصبي الكورتيكولوكية.
في الفئران، يدخل الجهاز البصري النواة الجينوليت الجانبية الظهرية (dLGN) من الموقع الكاودولتري، في حين تدخل الألياف الكورتيكوجينيكولات إلى الـ dLGN rostroventrally. وتسمح المسافة بين المدخلات بالتحقيق في الخصائص الفردية لمدخلات مختلفة جدا ً تُشدِّي على نفس الزنزانة. هنا، ونحن نبني على وتحسين طريقة تشريح وصفها سابقا التي يتم الحفاظ على ألياف retinogeniculate وcorticogeniculate في شرائح الدماغ الحاد3. نحن، إذن، نصف التحقيق الكهربائي الفسيولوجي للخلايا العصبية التتابعية وتحفيز ألياف الرطنة والألياف الكورتيكولوكية مع أقطاب التحفيز خارج الخلية. وأخيرا، نحن نقدم بروتوكول لملء الخلايا العصبية التتابع مع biocytin والتحليل التشريحي اللاحقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نصف بروتوكول محسن ة استنادا ً إلى الطريقة3المنشورة سابقاً ، والذي يسمح بالتحقيق في احتمال كبير لإطلاق نقاط الاشتباك العصبي retinogeniculate وانخفاض احتمال إطلاق نقاط الاشتباك العصبي corticogeniculate من نفس الشريحة. هذا هو ذو أهمية كبيرة لأن هذه المدخلات اثنين تتفاعل مع بعضها البعض لتعد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) في مركز البحوث التعاونية (SFB) 1134 “الفرق الوظيفية” (J.v.E. و X.C.) ومنحة البحوث EN948/1-2 (J.v.E.).
Materials
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC 10 USB Double patch clamp amplifier | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261-250MG | |
| CaCl2 | EMSURE | 1.02382.1000 | |
| choline chloride | Sigma-Aldrich | C1879-1KG | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CsCl | EMSURE | 1.02038.0100 | |
| Cs-gluconate | Self-prepared | Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves | |
| D-600 | Sigma-Aldrich | M5644-50MG | methoxyverapamil hydrochloride |
| D-APV | Biotrend | BN0085-100 | NMDA-receptor antagonist |
| Digital camera for microscope | Olympus | XM10 | |
| EGTA | SERVA | 11290.02 | |
| Forene | Abbvie | 2594.00.00 | isoflurane |
| Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-1KG | |
| HEPES | ROTH | 9105.2 | |
| High Current Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A385 | |
| KCl | EMSURE | 1.04936.1000 | |
| MgCl2 | EMSURE | 1.05833.0250 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM7 | |
| Miroscope | Olympus | BX51 | |
| mounting medium | ThermoFisher Scientific | P36930 | Prolong Gold Invitrogen |
| NaCl | ROTH | 3957.1 | |
| NaH2PO4 | EMSURE | 1.06346.1000 | |
| NaHCO3 | EMSURE | 1.06329.1000 | |
| Pipette | Hilgenberg | 1807502 | |
| Puller | Sutter | P-1000 | |
| razor blade | Personna | 60-0138 | |
| Semiautomatic Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | |
| SR 95531 hydrobromide | Biotrend | AOB5680-10 | GABAA-receptor antagonist |
References
- Guido, W. Development, form, and function of the mouse visual thalamus. Journal of Neurophysiology. 120, 211-225 (2018).
- Guillery, R. W., Feig, S. L., Lozsadi, D. A. Paying attention to the thalamic reticular nucleus. Trends in Neurosciences. 21, 28-32 (1998).
- Turner, J. P., Salt, T. E. Characterization of sensory and corticothalamic excitatory inputs to rat thalamocortical neurones in vitro. The Journal of Physiology. 510 (3), 829-843 (1998).
- Lindstrom, S., Wrobel, A. Frequency dependent corticofugal excitation of principal cells in the cat’s dorsal lateral geniculate nucleus. Experimental Brain Research. 79, 313-318 (1990).
- Granseth, B., Ahlstrand, E., Lindstrom, S. Paired pulse facilitation of corticogeniculate EPSCs in the dorsal lateral geniculate nucleus of the rat investigated in vitro. The Journal of Physiology. 544, 477-486 (2002).
- Hamos, J. E., Van Horn, S. C., Raczkowski, D., Uhlrich, D. J., Sherman, S. M. Synaptic connectivity of a local circuit neurone in lateral geniculate nucleus of the cat. Nature. 317, 618-621 (1985).
- Kielland, A., et al. Activity patterns govern synapse-specific AMPA receptor trafficking between deliverable and synaptic pools. Neuron. 62, 84-101 (2009).
- Chen, C., Regehr, W. G. Developmental remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 28, 955-966 (2000).
- Budisantoso, T., Matsui, K., Kamasawa, N., Fukazawa, Y., Shigemoto, R. Mechanisms underlying signal filtering at a multisynapse contact. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 2357-2376 (2012).
- Morgan, J. L., Berger, D. R., Wetzel, A. W., Lichtman, J. W. The Fuzzy Logic of Network Connectivity in Mouse Visual Thalamus. Cell. 165, 192-206 (2016).
- Usrey, W. M., Reppas, J. B., Reid, R. C. Paired-spike interactions and synaptic efficacy of retinal inputs to the thalamus. Nature. 395, 384-387 (1998).
- Steriade, M., Jones, E. G., McCormick, D. A. . Thalamus. , (1997).
- Wang, W., Jones, H. E., Andolina, I. M., Salt, T. E., Sillito, A. M. Functional alignment of feedback effects from visual cortex to thalamus. Nature Neuroscience. 9, 1330-1336 (2006).
- Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annual Review of Physiology. 64, 355-405 (2002).
- Chen, C., Blitz, D. M., Regehr, W. G. Contributions of receptor desensitization and saturation to plasticity at the retinogeniculate synapse. Neuron. 33, 779-788 (2002).
- Chen, X., Aslam, M., Gollisch, T., Allen, K., von Engelhardt, J. CKAMP44 modulates integration of visual inputs in the lateral geniculate nucleus. Nature Communications. 9, 261 (2018).
- Krahe, T. E., El-Danaf, R. N., Dilger, E. K., Henderson, S. C., Guido, W. Morphologically distinct classes of relay cells exhibit regional preferences in the dorsal lateral geniculate nucleus of the mouse. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 17437-17448 (2011).
- von Engelhardt, J., et al. CKAMP44: a brain-specific protein attenuating short-term synaptic plasticity in the dentate gyrus. Science. 327, 1518-1522 (2010).
- Khodosevich, K., et al. Coexpressed auxiliary subunits exhibit distinct modulatory profiles on AMPA receptor function. Neuron. 83, 601-615 (2014).
- Farrow, P., et al. Auxiliary subunits of the CKAMP family differentially modulate AMPA receptor properties. eLife. 4, e09693 (2015).
- Rafols, J. A., Valverde, F. The structure of the dorsal lateral geniculate nucleus in the mouse. A Golgi and electron microscopic study. The Journal of Comparative Neurology. 150, 303-332 (1973).
- Hauser, J. L., Liu, X., Litvina, E. Y., Chen, C. Prolonged synaptic currents increase relay neuron firing at the developing retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 112, 1714-1728 (2014).
- Hooks, B. M., Chen, C. Distinct roles for spontaneous and visual activity in remodeling of the retinogeniculate synapse. Neuron. 52, 281-291 (2006).
- Liu, X., Chen, C. Different roles for AMPA and NMDA receptors in transmission at the immature retinogeniculate synapse. Journal of Neurophysiology. 99, 629-643 (2008).
- Govindaiah, G., Cox, C. L. Metabotropic glutamate receptors differentially regulate GABAergic inhibition in thalamus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 13443-13453 (2006).
- Fogerson, P. M., Huguenard, J. R. Tapping the Brakes: Cellular and Synaptic Mechanisms that Regulate Thalamic Oscillations. Neuron. 92, 687-704 (2016).
- Jacobsen, R. B., Ulrich, D., Huguenard, J. R. GABA(B) and NMDA receptors contribute to spindle-like oscillations in rat thalamus in vitro. Journal of Neurophysiology. 86, 1365-1375 (2001).
- Kulik, A., et al. Distinct localization of GABA(B) receptors relative to synaptic sites in the rat cerebellum and ventrobasal thalamus. The European Journal of Neuroscience. 15, 291-307 (2002).
- Gutierrez, C., Cox, C. L., Rinzel, J., Sherman, S. M. Dynamics of low-threshold spike activation in relay neurons of the cat lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 1022-1032 (2001).
- Armstrong, C. M., Gilly, W. F. Access resistance and space clamp problems associated with whole-cell patch clamping. Methods in Enzymology. 207, 100-122 (1992).
- White, J. A., Sekar, N. S., Kay, A. R. Errors in persistent inward currents generated by space-clamp errors: a modeling study. Journal of Neurophysiology. 73, 2369-2377 (1995).
- Clay, J. R., Shlesinger, M. F. Analysis of the effects of cesium ions on potassium channel currents in biological membranes. Journal of Theoretical Biology. 107, 189-201 (1984).
