L’imagerie spectrale est devenue une solution fiable pour l’identification et la séparation des signaux de fluorescence multiples dans un seul échantillon et peut facilement distinguer les signaux d’intérêt du fond ou de l’autofluorescence. L’imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation améliore cette technique en diminuant le temps d’acquisition d’image nécessaire tout en augmentant simultanément le rapport signal-bruit.
Plusieurs techniques reposent sur la détection des signaux de fluorescence pour identifier ou étudier des phénomènes ou pour élucider les fonctions. La séparation de ces signaux de fluorescence s’est avérée lourde jusqu’à l’avènement de l’imagerie hyperspectrale, dans laquelle les sources de fluorescence peuvent être séparées les unes des autres ainsi que des signaux de fond et de l’autofluorescence (étant donné la connaissance de leurs signatures). Cependant, l’imagerie hyperspectrale traditionnelle de balayage des émissions souffre de temps d’acquisition lents et de faibles rapports signal-bruit en raison du filtrage nécessaire de l’excitation et de la lumière des émissions. Il a déjà été démontré que l’imagerie hyperspectrale de balayage d’excitation réduit le temps d’acquisition nécessaire tout en augmentant simultanément le rapport signal-bruit des données acquises. À l’aide d’équipements disponibles dans le commerce, ce protocole décrit comment assembler, calibrer et utiliser un système de microscopie d’imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation pour séparer les signaux de plusieurs sources de fluorescence dans un seul échantillon. Bien que très applicable à l’imagerie microscopique des cellules et des tissus, cette technique peut également être utile pour tout type d’expérience utilisant la fluorescence dans laquelle il est possible de varier les longueurs d’onde d’excitation, y compris, mais sans s’y limiter: l’imagerie chimique, applications environnementales, soins oculaires, sciences alimentaires, sciences médico-légales, sciences médicales et minéralogie.
L’imagerie spectrale peut être réalisée de diverses façons et est mentionnée par plusieurs termes1,2,3,4. En général, l’imagerie spectrale désigne les données acquises dans au moins deux dimensions spatiales et une dimension spectrale. L’imagerie multispectrale et hyperspectrale se distingue le plus souvent par le nombre de bandes de longueur d’onde ou par le fait que les bandes spectrales sont contigus1. Pour cette application, les données hyperspectrales sont définies comme des données spectrales acquises avec des bandes de longueur d’onde contigus obtenues par espacement des longueurs d’onde du centre au moins la moitié de la largeur totale à la moitié maximale (FWHM) de chaque filtre de bandepass utilisé pour l’excitation (c.-à-d., 5 nm espacement de longueur d’onde centrale pour les filtres bandpass avec des bandes passantes de 14-20 nm). La nature contigue des bandes de données permet un suréchantillonnage de l’ensemble de données, en veillant à ce que les critères de Nyquist soient satisfaits lors de l’échantillonnage du domaine spectral.
L’imagerie hyperspectrale a été développée par la NASA dans les années 1970 et 1980 en conjonction avec le premier satellite Landsat5,6. La collecte de données à partir de plusieurs bandes spectrales adjacentes a permis la génération d’un spectre d’éclat de chaque pixel. L’identification et la définition du spectre d’éclat des composants individuels ont permis non seulement de détecter les matériaux de surface par leurs spectres caractéristiques, mais aussi d’éliminer les signaux intermédiaires, tels que les variations du signal conditions atmosphériques. Le concept de détection des matériaux à l’aide de leurs spectres caractéristiques a été appliqué aux systèmes biologiques en 1996, lorsque Schck et coll. ont utilisé des combinaisons de cinq fluorophores différents et de leurs spectres connus pour distinguer les chromosomes étiquetés dans un processus appelé karyotypage spectral7. Cette technique a été élaborée en 2000 par Tsurui et coll. pour l’imagerie par fluorescence d’échantillons de tissus, à l’aide de sept colorants fluorescents et d’une décomposition de la valeur singulière pour obtenir la séparation spectrale de chaque pixel en combinaisons linéaires de spectres dans la référence. bibliothèque8. Semblable à leurs homologues de télédétection, la contribution de chaque fluorophore connu peut être calculée à partir de l’image hyperspectrale, donnée des informations a priori du spectre de chaque fluorophore.
L’imagerie hyperspectrale a également été utilisée dans les domaines de l’agriculture9, astronomie10, biomédecine11, imagerie chimique12, applications environnementales13, soins oculaires14, science alimentaire15, science médico-légale16,17, science médicale18, minéralogie19, et la surveillance20. Une limitation clé des systèmes actuels d’imagerie hyperspectrale au microscope fluorescence est que la technologie d’imagerie hyperspectrale standard isole les signaux de fluorescence dans les bandes étroites par 1) filtrant d’abord la lumière d’excitation pour contrôler l’excitation de l’échantillon, puis 2) le filtrage supplémentaire émis la lumière pour séparer l’émission de fluorescence en bandes étroites qui peuvent plus tard être séparées mathématiquement21. Le filtrage de l’éclairage d’excitation et de la fluorescence émise réduit la quantité de signal disponible, ce qui abaisse le rapport signal-bruit et nécessite de longs délais d’acquisition. Le faible signal et les longs délais d’acquisition limitent l’applicabilité de l’imagerie hyperspectrale en tant qu’outil de diagnostic.
Une modalité d’imagerie a été développée qui fait usage de l’imagerie hyperspectrale mais amplifie le signal disponible, réduisant ainsi le temps d’acquisition nécessaire21,22. Cette nouvelle modalité, appelée imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation, acquiert des données d’image spectrale en variant la longueur d’onde de l’excitation et en recueillant un large éventail de lumière émise. Il a déjà été démontré que cette technique donne des ordres de grandeur augmentations du rapport signal-bruit par rapport aux techniques de balayage des émissions21,22. L’augmentation du rapport signal-bruit est en grande partie due au large passage de bande (600 nm) de lumière d’émission détecté, tandis que la spécificité est fournie en filtrant seulement la lumière d’excitation au lieu de l’émission de fluorescence. Cela permet à toute la lumière émise (pour chaque longueur d’onde d’excitation) d’atteindre le détecteur21. En outre, cette technique peut être utilisée pour distinguer l’autofluorescence des étiquettes exogènes. En outre, la capacité de réduire le temps d’acquisition en raison de l’augmentation du signal détectable réduit le risque de photoblanchiment ainsi que permet des balayages spectrals à un taux d’acquisition qui est acceptable pour l’imagerie vidéo spectrale.
L’objectif de ce protocole est de servir de guide d’acquisition de données pour la microscopie d’imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation. En outre, des descriptions sont incluses qui aident à comprendre le chemin de lumière et le matériel. On décrit également la mise en œuvre d’un logiciel open-source pour un microscope d’imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation. Enfin, des descriptions sont fournies sur la façon de calibrer le système selon une norme traçable NIST, d’ajuster les paramètres logiciels et matériels pour obtenir des résultats précis et de démélanger le signal détecté en contributions de composants individuels.
L’utilisation optimale d’une imagerie hyperspectrale à balayage d’excitation commence par la construction du chemin lumineux. En particulier, le choix de la source lumineuse, des filtres (tunable et dichroic), de la méthode de commutation de filtre, et de la caméra déterminent la gamme spectrale disponible, la vitesse possible de balayage, la sensibilité de détecteur, et l’échantillonnage spatial. Les lampes à arc de mercure offrent de nombreux pics de longueur d’onde d’excitation, mais ne fournissent pas une sor…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs aimeraient reconnaître le soutien de NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, et le Abraham Cancer Mitchell Research Fund.
Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange (NDRI) | Isolated from human lung tissues obtained from NDRI | Highly autofluorescent, calcium sensitive cells |
Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | Remote-controllable shutter to minimize photobleaching |
Automated Stage | Prior Scientific | H177P1T4 | Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection. |
Automated Stage Controller (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | For interfacing automated stage with computer and joystick |
Buffer | Made in-house | Made in-house | 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3 |
Cell Chamber | ThermoFisher Scientific | Attofluor Cell Chamber, A7816 | Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination |
Excitation Filters | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88) |
Semrock Inc. | TBP01-402/16 | Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
Semrock Inc. | TBP01-449/15 | Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
Semrock Inc. | TBP01-501/15 | Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84) | |
Semrock Inc. | TBP01-561/14 | Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83) | |
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78) |
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86) |
GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; Plasmid #22692 | A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator |
Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used for accurate measurement of wide-angle illumination |
Inverted Fluorescence Microscope | Nikon Instruments | TE2000 | Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue. |
Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Labels mitochondria |
NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
NIST-Traceable Fluorescein | ThermoFisher Scientific | F36915 | For verifying appropriate spectral response of the system |
NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Labels cell nuclei |
Objective (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Useful for large fields of view |
Objective (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Most often used for tissue samples |
Objective (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Most often used for cell samples |
sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | For acquiring high-sensitivity digital images |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system |
Tunable Filter Changer | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching |
Xenon Arc Lamp | Sunoptic Technologies | Titan 300HP Lightsource | Light source with relatively uniform spectral output |