인간 뉴런의 렌 티 바이러스 매개 된 형질 도입을 이용한 타우 응집 연구를 위한 시험관 내 모델
Summary
이 프로토콜은 인간 신경 배양이 돌연변이 인간 타우를 코딩 하는 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트와 형질 도입 하는 절차를 자세히 설명 합니다. 형질 도입 배양은 타우 응집 체 및 관련 병 리를 표시 합니다.
Abstract
단백질 타우의 변종 응집은 병리학 적으로 알 츠 하이 머 병 (AD)을 비롯 한 다 수의 퇴행 성 신경 질환에 관여 한다. 동종 요법의 마우스 모델은 집계 된 타우의 신경 독성 메커니즘을 조사 하기 위한 귀중 한 자원을 제공 했지만, 신경 생리학의 종 간 차이로 인해 마우스 뇌는 적합 하지 않다는 것이 점차 명백 해지고 있습니다. 인간의 상태 모델링. 세포 배양 방법의 진보는 시험관에서 실험적인 사용을 위해 인간적 인 신경 배양을 접근 하 고 신경 치료제의 발달에 원조 했습니다 만들었습니다. 그러나, 인간 신경 세포 배양의 적응에도 불구 하 고, 인간 타우 병의 시험관 내 모델은 아직 널리 이용 되지 않는다. 이 프로토콜은 인간 뉴런이 황색 형광 단백질 (YFP) 리포터에 융합 된 병리학 적 돌연변이 타우에 대 한 코드를 렌 티 바이러스 유래 벡터로 형질 도입 하는 타우 응집의 셀룰러 모델을 기술 한다. 형질 도입 배양은 thioflavin에 대해 긍정적으로 얼룩을 발생 하는 타우 응집 체를 생산 하 고 신경 독성의 마커를 표시 합니다 (예: 감소 된 축 사 길이 및 증가 된 리소 소 양). 이 절차는 인간적 인 tauopathies를 공부 하기를 위한 유용 하 고 비용 효과적인 모형 일 수 있습니다.
Introduction
소 세관-관련 단백질 타우의 병리학 적 응집은 AD, 전방 측 두 성 치 매 (FTD), 픽의 질병 및 진보적인 수 아 핵 성 마비 (PSP)1을 포함 하는 많은 신경 변성 질환의 정의 특징 이다. 질병이 없는 상태에서, 타우는 뉴런 축 삭2에서 미세 구 필 라 멘 트에 결합 하 고 안정화 시킵니다. 그러나, 타우의 질병 관련과 인 산화는 타우 응집을 촉진 하 고, 미세 세관에서 해리 되며, 신경 독성3. 집계 된 tau의 독성 효과는 세포내 칼슘의 장애 조절을 초래 하 고, 최종적으로는 세포 사 멸을 유발 하는 콜린 성4 및 glutamatergic 수용 체의 변종 활성화를 수반할 수 있다. 동물 모델에서, 뇌 타우의 감소는 AD 마우스에서 병리학을 향상6 반복적 인 가벼운 외상 성 뇌 손상의 마우스 모델에서7.
장착 증거는 마우스 유래 타우의 구조와 결합 친화도가 인간 유래 타우와 구별 된다는 것을 보여주고, 마우스 타우는 인간 tauopathies 모델링에 부적합 하다8. 그러나, 인간 세포 동종 요법 모델은 널리 상업적으로 입수 가능 하지 않다. 이 작업의 전반적인 목표는 인간 뉴런이 돌연변이 인간 타우 컨스트 럭 트9를 포함 하는 렌 티 바이러스 유래 벡터로 형질 도입 타우 응집의 시험관 내 모델을 기술 하는 것 이다. 렌 티 바이러스 컨스트 럭 트를 유발 하는 타우 집합체는 yfp 리포터 (타우-wt-yfp)에 융합 된 야생 형 (wt) 타우 반복 도메인에 대 한 대조 군 코드를 생성 하는 반면, 타우 반복 도메인의 품고 P301L 및 V337M 돌연변이에 융합 하는 것 이다. 이 방법을 사용 하 여 형질 도입 신경 배양 물은 nontransduced 문화 보다 약 9 배 더 많은 타우를 표현 한다. 타우 발현의 과다 발현 양은 타우-르 DLM-YFP와 타우 Wt-형질 도입 세포 사이에서 대략적으로 동일 하지만, 타우-RDLM-YFP 디스플레이 응집 체로만 뉴런 형질 도입. 배양 액은 thioflavin 및 시 냅 스 밀도의 표시 감소에 대 한 긍정적 인 형질 도입-YFP 얼룩과 함께 제공 됩니다. 따라서,이 셀룰러 모델은 시험관 내에서 타우 응집을 연구 하기 위한 유용한 도구가 될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은은-얼룩 양성 응집 체 및 thioflavin 양성 신경 섬유의 엉 킴 (NFTs)을 전시 하는 인간 타우 병의 시험관 내 모델의 생성을 설명 합니다. 더욱이, 형질 도입 세포는 형태학 적 결함, 감소 된 synaptogenesis 및 증가 된 리소 소 부피와 같은 타우-유발 병 리를 표시 한다. 이 프로토콜의 주요 이점은 타우 독성의 분석 뿐만 아니라 약물 스크리닝 연구에 사용 될 수 있는 신경 병 증의 접근 및 비용 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 PHF-1과 CP13 항 체를 공급 하 고, 사우스 웨스턴 텍사스 대학교에서 마크 다이아몬드 박사를 제공 하 고, 타우의 구조를 제공할 수 있는 피터 데이비스 박사에 게 감사를 드립니다. 이 작품은 알 츠 하이 머 협회에서 보조금에 의해 지원 되었다 (니 렝-14-322164) S.H.Y. 및 재생 의학에 대 한 캘리포니아 연구소에서 (TB1-01193) P.R.
Materials
| 10 cm culture dishes | Thermofisher | 12556002 | |
| 15 ml tubes | Biopioneer | CNT-15 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermofisher | 50-980-487 | |
| 24 well culture plates | Thermofisher | 930186 | |
| 50ml tubes | Biopioneer | CNT-50 | |
| 70% ethanol in spray bottle | Various sources | NA | |
| B27 supplement | Thermofisher | 17504044 | |
| Basement membrane matrix (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Basic FGF | Biopioneer | HRP-0011 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| Cell culture incubator | Various sources | NA | |
| Centrifuge | Various sources | NA | |
| DMEM-F12 culture media with glutamine | Thermofisher | 10565042 | |
| Ethanol (50% concentration or higher) | Various sources | NA | |
| Flourescently labeled secondary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Fluorescent microscope | Various sources | NA | |
| Glass coverslips | Thermofisher | 1254581 | |
| Glass slides | Thermofisher | 12-550-15 | |
| Human neural stem cells | Various sources | NA | |
| Lentiviral vectors | Various sources | custom order | |
| Mounting media | Thermofisher | P36934 | |
| N2 supplement | Thermofisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline | Thermofisher | 14190250 | |
| Primary antibodies | Various Sources, experiment dependent | NA | |
| Rocking or rotating platform | Various sources | NA | |
| Sterile cell culture hood | Various sources | NA | |
| Thioflavin S | Sigma | T1892-25G | |
| Triton X-100 | Thermofisher | BP151-100 | |
| Water bath | Various sources | NA |
References
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