정화와 조직적 조상 세포의 이식 파생 듀 켄 씨 근 Dystrophic 쥐에서 심장 기능을 개선 하기 위해 Exosomes
Summary
여기, 선물이 정도 정상 조직적 조상 세포에서 파생 된 exosomes를 이식 하 여 듀 켄 씨 근이 영양 증 쥐에 심장 기능을 개선 하는 프로토콜.
Abstract
Duchene 근 위축 증 (DMD)은 X 연결 된 열성 유전 질환 기능 dystrophin 단백질 부족으로 인 한. 질병을 치료 수 없습니다, 그리고 및 질병 진행 되는 동안, 환자는 동 공이 확장 되어 심장 근육 병 증, 부정맥, 울 혈 심장 마비의 증상을 개발 합니다. DMDMDX 돌연변이 마우스 dystrophin, 표현 하지 않는 그리고의 DMD 쥐 모형으로 일반적으로 사용 됩니다. 우리의 최근 연구에서 그 intramyocardial 주입 와이드 타입 (WT)의 관찰-조직적 조상 세포에서 파생 된 exosomes (MPC-엑 소) 정도 연관 되었다 dystrophin DMDMDX 돌연변이 생쥐의 심근에서의 식을 복원 심장 기능을 제안에 일시적인 개선 WT-MPC-엑 소 DMD의 심장 증상을 완화 하는 옵션을 제공할 수 있습니다. 이 문서에서는 MPC-엑 소 정화 및 DMDMDX 돌연변이 생쥐의 마음에 이식 하는 기술을 설명합니다.
Introduction
듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD)은 X 연결 된 열성, 진보적인 신경 근육 학 질환 기능 dystrophin1의 손실과 DMD 유전자에 돌연변이 의해 발생. Dystrophin 골격 근육에 심근, 주로 표현 하 고 덜 부드러운 근육, 내 분 비 샘과 신경2,3에 표시 됩니다. DMD는 3500 5000 신생아 소년 전세계4,5에 하나씩의 발생률과 근 위축 증의 가장 일반적인 유형입니다. 개인은 일반적으로 진보적인 근육 괴 사, 손실 초기 청소년 기, 그리고 두 번째 제 3 년간 심장 마비 및 호흡6그들의 생활의 죽음에의 한 독립적인 지나가는의 개발.
동 공이 확장 되어 심장 근육 병 증, 부정맥 및 심부는 DMD7,8의 일반적인 심장 혈관 발현. 질병을 치료 수 없습니다, 지지 치료 증상을 향상 시킬 수 있습니다 또는 심장 마비의 진행을 지연 하지만 심장 기능9,10개선 하기는 매우 어렵습니다.
DMD 환자, X 연결 된 근이 영양 증과 유사한 (MDX) 마우스 dystrophin 단백질 및 심근11의 현재 증상에 결핍을 따라서 널리 관련 된 DMD 심근 연구에 사용 합니다. 영향을 받는 근육에 dystrophin 복원 하기 위해 수용자 줄기 세포 치료는 DMD12,,1314에 대 한 효과적인 치료로 입증 되었습니다. Exosomes, 30-150 nm 막 소포 다양 한 셀 형식에 의해 은닉 된다 메신저 RNA (mRNA) 등 비 코딩 RNAs15,16,17 유전 소재 전송을 통해 셀을 통신에 핵심적인 역할을 담당 ,,1819,,2021.
우리의 이전 연구 C2C12 셀 줄, 조직적 뿌리 세포 (MPC)에서 파생 된 exosomes dystrophin 전송할 수 있습니다 직접 심장 주입22, 후 호스트 cardiomyocytes에 mRNA의 배달 된 수용자를 나타내는 MPC 파생 된 exosomes (MPC-엑 소) 정도 MDX 쥐에 DMD 유전자 발현을 복원할 수 있습니다. 이 문서는 MPC-엑 소 정화 및 이식 기술에 초점을 맞추고.
Protocol
동물은 승인 된 프로토콜 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회 오 거 스타 대학에서 조오지 아의 의학 대학의의 동물 복지 규정에 따라 처리 합니다. 1. 격리와 MPC에서 파생 된 Exosomes의 정화 20 mL 완전 한 Dulbecco와 15 cm 세포 문화 접시에 시드 5 x 106 C2C12 셀이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린 G 및 100 μ g/mL 스 수정. 37 ° C, 5% CO2에서 …
Representative Results
분리 하 고 순화 C2C12 세포에서 exosomes에 대 한 흐름 차트는 그림 1에 표시 됩니다. Exosomes의 존재를 확인, 우리는 전송 전자 현미경 분석을 수행. 전송 전자 현미경 이미지 (그림 1B) 파생 하는 C2C12 exosomes의 밝고 둥근 모양 vesicles의 형태를 보여 줍니다. 서쪽 오 점 분석 exosome 마커, CD63 및 TSG101 등의 존재를 확인 했다 (<strong class="xf…
Discussion
순수한 exosomes를 분리 하는 방법은 exosomes의 기능을 공부에 대 한 필수적입니다. Exosome 격리에 대 한 일반적인 기술 중 하나는 폴 리 에틸렌 glycols (나무 못) 중재 강수량17,18,25입니다. Exosomes, 구슬에서 시 켰 던 고 저속 원심 분리에 의해 일지도. 못-중재 정화는 매우 편리 하 고, 낮은-비용, 어떤 고급 장비를 필요 하지 않습니다 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
당나라는 미국 심장 협회에 의해 부분적으로 지원 되었다: GRNT31430008, NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| 0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
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Cite This Article
Su, X., Shen, Y., Jin, Y., Jiang, M., Weintraub, N., Tang, Y. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. J. Vis. Exp. (146), e59320, doi:10.3791/59320 (2019).