تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي
Summary
وتعرض هذه الورقة طريقة جراحية لتشريح المورفولوجية شبكية العين الخوادر جنبا إلى جنب مع بروتوكولات لمعالجة الأنسجة إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، واستخراج الحمض النووي الريبي.
Abstract
الشبكية الخوادر المورفولوجية يوفر نظام نموذجا ممتازا لدراسة العمليات morphogenetic أثناء التطوير. في هذه الورقة، نقدم بروتوكول موثوقة لتشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية الدقيقة. نهجنا الجراحية يستخدم أدوات ميكروديسيكشن–متاحة بسهولة لفتح الخوادر ودقة استخراج مجمعات العين والدماغ. هذه يمكن ثابتة، ويتعرضون إيمونوهيستوتشيميستري، وشبكية العين ثم شنت على شرائح المجهر وتصويرها إذا كان الهدف الكشف عن الهياكل الخلوية أو سوبسيلولار. بدلاً من ذلك، يمكن تكون معزولة عن أنسجة المخ شبكية العين غير المثبتة وتفكيك في المخازن المؤقتة المناسبة وتستخدم لاستخراج التفريد أو مرناً هلام بروتين (لتقييم تعبير البروتين أو الجينات، على التوالي). ممارسة هامة والصبر قد يكون مطلوباً للماجستير في بروتوكول ميكروديسيكشن ووصف، ولكن حالما يتقن، البروتوكول يمكن عزلة سريعة نسبيا من شبكية العين أساسا غير التالفة.
Introduction
المورفولوجية الشبكية تتكون من حوالي 750 ommatidia محاطة بالخلايا الصبغية مرتبة في قرص العسل شعرية1،2،،من34. كل أوماتيديوم يحتوي على ثمانية من الخلايا العصبية مستقبله وأربع خلايا المخروط إفراز عدسة خليتين الصباغ الأولية. المحيطة بكل أوماتيديوم هي الخلايا المنتجة لصبغة شعرية ومجموعات شعيرات حسية. نظراً للطبيعة الانقسامية بعد وترتيب سداسية النمطية، يوفر الشبكية الخوادر المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا لدراسة العمليات مورفوجينيتيك بما في ذلك خلية التصاق5،6، 7،،من89،10 والمبرمج11،12،13،،من1415.
تستخدم العديد من البروتوكولات المنشورة ضغط الهواء لاستخراج مجمعات العين والدماغ من المورفولوجية الخوادر16،،من1718. البروتوكول هو موضح هنا بدلاً من ذلك يستخدم أدوات ميكروديسيكشن بعناية ودقة عزل مجمعات العين والدماغ بهدف الحصول على نسيج الشبكية غير التالفة. هذا أمر بالغ الأهمية إذا كانت ستستخدم لشبكية العين المورفولوجية، والبروتين، أو التعبير الجيني يحلل حيث يمكن أن يؤدي إلى تلف شبكية العين الإجهاد الخلوية أو الموت، والتي يمكن أن تعدل تعبير النمط الظاهري أو الجينات الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، بعد الممارسة، يمكن أن تكون معزولة في 10 إلى 15 دقيقة، تيسير تحقيق هدف تقليل التقلبات في العمر ومرحلة النمو من نسيج العين تشريح 6 إلى 10 مجمعات العين والدماغ.
التثبيت، وإيمونوستينينج، وبروتوكول الجامعة-جبل الموصوفة أدناه مناسبة لإعداد عيون المورفولوجية للفحص المجهري نيون. يمكن المحتضنة شبكية العين مع الأجسام المضادة لاستهداف البروتينات ذات الاهتمام. على سبيل المثال، يمكن استخدام أجسام مضادة لمكونات مفرق أدهيرينس تصور سيركومفيرينسيس قمي من الخلايا حتى تكون الخصائص بما في ذلك نوع الخلية، الشكل والترتيب المقررة19. قبل التثبيت، يمكن بدلاً من ذلك أن المشقوق عيون من الدماغ غرض استخراج البروتين للتحليل الغربي، أو الحمض النووي الريبي للاستخدام في قرة-PCR أو تسلسل الحمض النووي الريبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة تشريح العين الخوادر المورفولوجية الموصوفة هنا يسمح للعزلة من 6 إلى 10 مجمعات العين في الدماغ خلال 10 إلى 15 دقيقة. ومع ذلك، الصبر والممارسة ضرورية بغية إتقان تقنية تشريح وتحسين نوعية وسرعة من تشريح. يضمن هذا الوقت القصير تشريح كل عين تقريبا المرحلة الإنمائية ذاتها، الحد من تقلب في ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر طبل زاك ولدينا المراجعين لتعليقات مفيدة على المخطوطة. وأيد هذا العمل R15GM114729.
Materials
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. . The development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. 发育生物学. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O’Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
