Längsschnitt-Intravital-Bildgebung des Hirntumorzellverhaltens als Reaktion auf eine invasive chirurgische Biopsie
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur hochauflösenden Zeitraffer-Multiphotonen-Bildgebung von Hirntumorzellen vor und nach invasiven chirurgischen Eingriffen (z.B. Biopsie) innerhalb desselben lebenden Tieres. Diese Methode ermöglicht es, die Auswirkungen dieser invasiven chirurgischen Eingriffe auf das wandernde, invasive und proliferative Verhalten von Tumorzellen auf einer einzelnen Zellebene zu untersuchen.
Abstract
Biopsien sind Standard der Behandlung von Krebs und sind klinisch vorteilhaft, da sie eine solide Tumordiagnose, Prognose und personalisierte Behandlungsbestimmung ermöglichen. Jedoch, Störung der Tumorarchitektur durch Biopsie und andere invasive Verfahren wurde mit unerwünschten Auswirkungen auf die Tumorprogression verbunden, die gründlich untersucht werden müssen, um den klinischen Nutzen dieser Verfahren weiter zu verbessern. Herkömmliche statische Ansätze, die nur eine Momentaufnahme des Tumors liefern, sind in ihrer Fähigkeit eingeschränkt, die Auswirkungen der Biopsie auf das Verhalten von Tumorzellen wie Migration aufzudecken, ein Prozess, der eng mit Tumormalignität zusammenhängt. Insbesondere die Tumorzellmigration ist der Schlüssel bei hochaggressiven Hirntumoren, bei denen die lokale Tumorverbreitung eine totale Tumorresektion praktisch unmöglich macht. Die Entwicklung von Multiphotonenbildgebung und chronischen Bildgebungsfenstern ermöglicht es Wissenschaftlern, diesen dynamischen Prozess bei lebenden Tieren im Laufe der Zeit zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Methode zur hochauflösenden Längsbildgebung von Hirntumorzellen vor und nach einer Biopsie bei demselben lebenden Tier. Dieser Ansatz ermöglicht es, die Auswirkungen dieses Verfahrens auf das Verhalten von Tumorzellen (Migration, Invasion und Proliferation) zu untersuchen. Darüber hinaus diskutieren wir die Vorteile und Grenzen dieser Technik sowie die Fähigkeit dieser Methode, Veränderungen im Krebszellverhalten für andere chirurgische Eingriffe zu untersuchen, einschließlich Tumorresektion oder die Implantation von Chemotherapien. Wafer.
Introduction
Der Standard der Pflege für die meisten soliden Tumoren umfasst Gewebebiopsie zur Diagnose, Prognose und personalisierte Behandlungsbestimmung1,2. Insgesamt bieten diese Verfahren klinischen Nutzen, aber neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Biopsie und andere invasivere Verfahren, wie die Tumorresektion, auch die Tumorprogression negativ beeinflussen können3,4,5 , 6. Während diese Verfahren nach wie vor unverzichtbar sind und ihre Vorteile ihre negativen Auswirkungen überwinden, ist es notwendig, die Mechanismen hinter diesen negativen Auswirkungen vollständig zu verstehen, um die Sicherheit der Patienten und die positive Einflüsse dieser Verfahren und machen sie noch klinisch vorteilhafter.
Biopsievermittelte unerwünschte Auswirkungen auf die Tumorprogression werden durch systemische Veränderungen und Veränderungen in der Tumormikroumgebung als Reaktion auf Gewebestörungen ausgelöst4,5. Daher ist es notwendig, diesen Prozess bei lebenden Tieren zu untersuchen. Die subtilen Folgen dieser minimalinvasiven Eingriffe können jedoch oft durch große Unterschiede zwischen Individuen verschleiert werden. Herkömmliche Methoden, die auf Immunhistochemie oder Transkriptionsanalyse basieren, können diese Effekte übersehen oder eine große Anzahl von Tieren erfordern, um sie zu identifizieren. Darüber hinaus fehlt es diesen statischen Ansätzen an der Fähigkeit, Veränderungen im Tumorzellverhalten wie Migration und Invasion, dynamische Prozesse, die mit Tumormalignität korrelieren, zu identifizieren. Diese Tumorzellmerkmale sind von besonderer Bedeutung für hochaggressive Hirntumoren wie Glioblastom multiforme (GBM), wo die lokale Ausbreitung von Tumorzellen die chirurgische Resektion einschränkt und das Überleben des Patienten verringert7. Um vollständig zu verstehen, wie Biopsien das Verhalten von GBM-Zellen beeinflussen, ist ein Längsschnittansatz erforderlich, der die Visualisierung dieser Zellen im physiologischen Kontext lebender Organismen ermöglicht.
Die jüngste Entwicklung einer hochauflösenden intravitalen Bildgebung in Kombination mit chirurgisch implantierten chronischen Bildgebungsfenstern ermöglicht es Wissenschaftlern, das dynamische Verhalten von Tumorzellen bei lebenden Mäusen über mehrere Tage zu untersuchen8,9. Mit diesem leistungsstarken Ansatz können wir untersuchen, wie sich das proliferative, wandernde und infiltrative Verhalten von Tumorzellen über mehrere Tage als Reaktion auf eine Biopsie in derselben Maus ändert. Im Vergleich zu anderen Techniken, die eine mehrtägige Überwachung von Tumoren bei lebenden Mäusen ermöglichen, wie Magnetresonanztomographie (MRT)10, Positronenemissionstomographie/Computertomographie (PET/CT)11oder biolumineszierende Ansatz bietet auf einzigartige Weise die Möglichkeit, das Verhalten der Tumorzelle auf Einzelzellebene zu untersuchen und subtile Veränderungen innerhalb des Tumors zu entwirren.
Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Durchführung biopsieähnlicher Verletzungen und einer prä- und postbiopsielichen Längs-Intravital-Bildgebung im Gehirn tumortragender Mäuse. Diese Methode kann möglicherweise angewendet werden, um andere chirurgische Eingriffe zu untersuchen, wie z. B. die partielle Tumorresektion oder die Implantation von Chemotherapie-Wafern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir eine Methode, um Veränderungen im Verhalten von Tumorzellen auf Einzelzellebene als Reaktion auf invasive chirurgische Eingriffe, wie eine Biopsie, im Gehirn eines lebenden Tieres zu untersuchen. Die Kombination von Längs-Multiphotonen-Bildgebung mit der chirurgischen Implantation eines chronischen CIW ermöglicht die Quantifizierung von Tumorzellmigration, Invasion und Proliferation vor und nach der Biopsie im selben Tier4. Im Vergleich zu anderen Ansätzen, die für die Mehrtagesüberwachung von Tumoren verwendet werden, wie z. B. biolumineszierende Bildgebung12, MRT10oder PET/CT11, visualisiert diese Methode Tumore auf einer einzelzelligen Ebene und bietet somit Einblicke in das zelluläre Verhalten. zugrunde liegende Tumorprogression.
Um diese Methode erfolgreich auszuführen, sollten mehrere Prozeduren gemastert werden. Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind die CIW-Implantation und der Austausch. Die technische Komplexität dieser Schritte erfordert Präzision und chirurgische Fähigkeiten, die mit stetiger Ausbildung erworben werden können. Komplikationen während der CIW-Operation, wie Blutungen, die die Gehirnoberfläche bedecken können, können sich als Herausforderung für die nachfolgende Bildgebung erweisen. Ein Mangel an sterilen Werkzeugen oder Umgebung, sowie das Versäumnis, die Gehirnoberfläche vollständig zu versiegeln, kann eine Infektion auf der Gehirnoberfläche verursachen (weiße Flüssigkeit unter dem Deckel), die die Bildgebung problematisch macht und die resultierenden auslegung. Ein weiteres häufiges Problem dieses Protokolls ist die Bewegung von Tieren während der Zeitraffer-Bildgebung. Während jede Xyzverschiebung nach dem Experiment korrigiert werden kann, wird empfohlen, die Koordinate jeder Position vor jedem Zeitpunkt zu korrigieren, um Informationsverluste zu verhindern. Die Gewebeverformung ist ein zusätzliches Problem, das bei der Bildgebung auf einem invertierten Mikroskop gefunden wird. Hirngewebe leidet unter Kompression, wenn die Maus in Supine-Position platziert wird. Je nach Grad der Gewebeverformung kann die Tumorzellverfolgung zu einer fehlerhaften Quantifizierung der Zellverschiebung führen. Um dies zu verhindern, kann eine Software für starre und elastische Verformung verwendet werden14.
Während dieses Verfahren eine breite Anwendung für die Untersuchung von Veränderungen im Tumorverhalten bietet, sollten bestimmte Einschränkungen in Betracht gezogen werden. Diese Methode ermöglicht es Wissenschaftlern, Bis zu einer Tiefe von 1,6 mm abzubilden (mit einem optischen parametrischen Oszillator); Dies bedeutet jedoch, dass die Bildgebung auf oberflächliche Hirnrindenbereiche beschränkt ist15. Daher können einige Hirntumoren, die sich in tiefen Gehirnstrukturen befinden, einschließlich diffuser intrinsischer Pontingliome, die sich in der Hirnstammregion befinden, mit diesem Protokoll nicht in ihrer ursprünglichen Gehirnumgebung untersucht werden. Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist das Volumen des Tumors, der abgebildet werden kann. Obwohl das gesamte Tumorvolumenscannen gewünscht wird, um maximale Informationen zu erhalten, können Tumorgröße und die Geschwindigkeit von Migrationszellen oft einschränkende Faktoren sein. Für jeden Tumortyp muss ein optimaler Zeitraffer für die Bildgebung in Betracht gezogen werden. Wenn der Zeitrahmen zwischen den Bildern zu lang ist, kann es schwierig sein, die Tumorzellen zu verfolgen. Die Verwendung eines Resonanzscanners kann die Scanzeit stark verringern und die Bildgebung eines größeren Tumors ermöglichen16. Schließlich kann die manuelle Bildanalyse dieses Protokolls sehr zeitaufwändig sein, so dass stattdessen Programme für die automatisierte 3D-Verfolgung verwendet werden können. Das Ergebnis der Nachverfolgung sollte jedoch immer visuell überwacht werden, da Algorithmen für die automatisierte Zellverfolgung selten so konzipiert sind, dass sie genau die Migration der von Interesse interessierten Zellen rekapitulieren.
Leichte Anpassungen des hier beschriebenen Protokolls können ein noch breiteres Anwendungsspektrum ermöglichen. Anstelle von Biopsien können andere (chirurgische) Eingriffe durchgeführt werden, wie z. B. eine partielle Tumorresektion oder die Lieferung von Chemotherapie-Wafern. Die Zugabe von Verbindungen durch ein chirurgisch implantiertes Mikrorohr kann mit diesem Protokoll kombiniert werden, um spezifische Moleküle von Interesse pharmakologisch anzusprechen. Wir erwarten, dass dieses Modell in Studien nützlich sein wird, die darauf abzielen, die Auswirkungen eines bestimmten Eingriffs auf das Verhalten von Tumorzellen zu analysieren. Die Möglichkeit, wiederholte Maßnahmen am selben Tier durchzuführen, liefert nicht nur genauere Daten über Veränderungen im Tumor, sondern reduziert auch die Anzahl der Pro-Tier-Experimente, die pro Studie benötigt werden, erheblich.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Anko de Graaff und dem Hubrecht Imaging Center für ihre bildgebende Unterstützung und Ellen Wehrens und Hannah Johnson für das Korrekturlesen und Bearbeiten des Manuskripts.
Materials
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
- Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine. Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).
- van Malenstein, H., et al. Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).
- Kretschmer, L., et al. High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371). British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).
- Alieva, M., et al. Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior. Scientific Reports. 7, 7529 (2017).
- Hobson, J., et al. Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis. Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).
- Weil, S., et al. Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas. Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).
- Parsa, A. T., et al. Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults. Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31, 602-606 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4, 158ra145 (2012).
- Schreurs, T. J., et al. Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy. PLOS ONE. 11, e0165759 (2016).
- Nielsen, C. H., et al. PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide. 癌症研究. 70, 9022-9030 (2010).
- Alieva, M., et al. Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response. PLOS ONE. 7, e35148 (2012).
- Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window. Journal of Visualized Experiment. (28), e1278 (2009).
- Noordmans, H. J., Roode, R. d., Staring, M., Verdaasdonk, R. . Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time. , (2006).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16, 106014 (2011).
- Kirkpatrick, N. D., et al. Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment. IntraVital. 1, (2012).
