Summary

Lentivirale Vector Platform voor de efficiënte levering van Epigenome-bewerkingsgereedschap in mens geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige ziekte modellen

Published: March 29, 2019
doi:

Summary

Gerichte DNA epigenome bewerken vertegenwoordigt een krachtige therapeutische aanpak. Dit protocol beschrijft de productie, reiniging en concentratie van de alles-in-één lentivirale vectoren herbergen van de CRISPR-dCas9-DNMT3A-transgenic voor bewerken van epigenome’s in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-afgeleid van neuronen.

Abstract

Het gebruik van hiPSC-afgeleide cellen vormt een waardevolle aanpak voor het bestuderen van menselijke neurodegeneratieve ziekten. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol voor de differentiatie van hiPSCs die zijn afgeleid van een patiënt met de verdrievoudiging van de alpha-synuclein gen (SNCA) locus in Parkinson’s disease (PD)-relevante Dopaminerge neuronale populaties. Accumulatie van bewijsmateriaal blijkt dat hoge niveaus van SNCA oorzakelijke voor de ontwikkeling van PD. erkennende de onvervulde behoefte om nieuwe therapeutische benaderingen voor PD, met name die welke gericht op de regulering van de expressie van de SNCA , wij recent ontwikkelde een CRISPR/dCas9 DNA-methylering-gebaseerde systeem voor epigenetically moduleren SNCA transcriptie door methylatie niveaus op de SNCA intron 1 regelgevende regio verrijken. Te leveren van het systeem, bestaande uit een dode (gedeactiveerd) versie van Cas9 (dCas9), gesmolten met het katalytische domein van de DNA methyltransferase enzym 3A (DNMT3A), een lentivirale vector wordt gebruikt. Dit systeem wordt toegepast op cellen met de verdrievoudiging van het SNCA locus en vermindert de SNCA-mRNA en eiwitniveaus met ongeveer 30% door de gerichte methylation van DNA van SNCA intron 1. De verfijnd Downregulatie van de niveaus van SNCA redt ziekte verband houdende cellulaire fenotypen. In het huidige protocol streven wij naar een stapsgewijze procedure voor het differentiëren van hiPSCs in de neurale voorlopercellen (NPC) en de vestiging en de validatie van pyrosequencing tests voor de beoordeling van het profiel van de methylering in de SNCA beschrijven intron 1. Overzichtsweergave in meer detail de lentivirus-CRISPR/dCas9-systeem dat wordt gebruikt in deze experimenten, wordt dit protocol beschreven hoe produceren, zuiveren en concentreren van lentivirale vectoren en markeer hun geschiktheid voor epigenome – en genoom-editing applicaties met behulp van hiPSCs en NPC’s. Het protocol is eenvoudig aan te passen en kan worden gebruikt voor het produceren van hoge titer lentivirussen voor in vitro en in vivo toepassingen.

Introduction

Meerdere epigenome-bewerken platformen zijn onlangs ontwikkeld te richten op een DNA-sequenties in de regio’s waarmee gene expression1,2. De gemaakte epigenome-bewerkingsgereedschap zijn ontworpen om (i) het reguleren van transcriptie, (ii) veranderen posttranslationele histone modificaties, (iii) wijzigen methylation van DNA en (iv) het moduleren van regelgevende element interacties. De aanpak van het verankeren van de transcriptie/chromatine modifiers om een gedeactiveerde (dode) Cas9 (dCas9) verhoogd van eerder ontwikkelde epigenome-bewerken platforms, zoals zink eiwitten (ZFPs) en transcriptie activator-achtige effectoren (verhalen), vinger herbergen een potente transcriptionele effector domein (ED) gesmolten aan het ontworpen DNA-bindende domein (DBD)3. De resultaten van het gewenste fenotype zoals activering of repressie wordt gedefinieerd door het effector molecuul verankerd aan de endogene loci (Figuur 1). Als u wilt maken van programmeerbare transcriptionele activators, zijn dCas9/gRNA modules gekoppeld aan VP164,5,6 (figuur 1A), een virale activering domein dat Pol II en de algemene transcriptie machines werft. De wijziging van dit systeem heeft VP64, een tetrameer van VP16 domeinen, die een nog robuustere activering tarief5,6bieden: opgenomen. Het systeem heeft met succes gewerkt codering en noncoding regio’s activeren door zich te richten initiatiefnemers en regelgevende elementen. Nog belangrijker is, hoewel VP64 moleculen niet rechtstreeks de structuur van de chromatine in de target-regio wijzigen, werft het chromatine modifiers dat resultaten in depositie van de actieve (euchromatine) merken bindt, met inbegrip van H3/H4 acetylation en H3-K4 di / Tri-methylering5,6. Naast VP64, heeft de p65-subunit van de menselijke NF-recombination complex is vastgebonden aan de dCas9/gRNA module7. Interessant, het binden van deze effectoren aan de regio’s stroomopwaarts van transcriptie start sites (TSSs) en binnen initiatiefnemers resulteert in een sterke gen-inductie. VP64 en p65 effectoren kunnen echter ook de activatory effecten uitoefenen terwijl het wordt gekoppeld aan de regio’s gelegen stroomafwaarts van TSSs en op de versterkers van de distale7,8. Om een meer robuuste transcriptionele antwoord ontlokken, moeten meerdere dCas9-VP64 of dCas9-p65-fusies worden aangeworven naar een enkel doel locus9,10. Als zodanig, heeft de recente ontwikkeling van volgende-generatie activators, die meerdere effector domeinen door een enkele dCas9-gRNA-complex, zoals SunTag werven, geleid tot een sterkere activering vermogen te vergelijken met dCas9-VP64 fusion tegenhangers11 , 12. een verbeterde transcriptionele activering is verkregen door middel van de fusie van VP64, p65 en Rta (VPR), een domein van de transactivation van de gamma-infectieziekte, aan de C-terminus van dCas913 (figuur 1A). Vergelijkbare CRISPR/dCas9-systemen hebben ontwikkeld voor doelgroepen gerichte repressie (figuur 1B).

Endogene gene repressie kan worden bereikt met gemanipuleerde onderdrukker fusies via allerlei mechanismen (figuur 1B). Is gebleken dat CRISPR/dCas9 systemen, gekoppeld aan de onderdrukker DBD (zelfs zonder een effector domein/s), efficiënt genexpressie zwijgen kunnen terwijl vastgebonden aan een promotor of stroomopwaarts/stroomafwaarts-TSS regio’s3,6 ,14. De gevolgen voor de transcriptie wordt veroorzaakt door de sterische inmenging van transcription factor binding en RNA polymerase verwerking. Echter zijn uitgebreidere benaderingen nodig, zoals gene repressie door de sterische hinder alleen vaak niet voor robuuste silencing volstaat. De recente ontwikkeling van de volgende generatie van geluiddempers op basis van CRISPR/dCas9 systemen uitvoering transcriptionele onderdrukker domeinen (TRDs), histone modifiers (H3-K9 di-/ tri-methylering, H3-K27 di-/ tri-methylering; H3-K36 di-/ tri-methylering, H3/H4 deacetylation), en methylation van DNA (CpG) leidde tot de bouw van epigenetische hulpmiddelen waardoor meer robuuste silencing effecten4,5,15,16, 17,18,19,20. Het is aangetoond dat de aanwerving van deze epigenetische modifiers tot het DNA dat kan leiden tot de vorming van meer gesloten en gecondenseerde chromatine, die meestal een meer potente silencing resultaat21,22te genereren. De meest voorkomende silencing domein gebruikt met DBDs is de Krüppel-geassocieerde vak (KRAB)4,5. De aanwerving van de factor is gebleken om te corresponderen met de chromatine wijzigingen; de mechanismen van deze wijzigingen zijn echter nog opgehelderd16,17,18. Onlangs is gebleken dat de lokalisatie van KRAB aan DNA kan de bevordering van de vergadering van de Histon methyltransferase SETDB1 en de Histon deacetylation (HDAC) NuRD complexen, suggereren de mogelijkheid dat deze interacties de vorming van bemiddelen condensatie van de chromatine en transcriptionele silencing3,13. Als een alternatieve benadering, kunnen effector domeinen worden gesmolten tot DBDs maken van een aangepaste epigenetische silencing eiwit. Dit systeem katalyseert direct repressieve DNA merken of Histon modificaties.

Onlangs, heeft het gebruik van synthetische CRISPR/dCas9 systemen vastgebonden aan het DNMT3A enzym is voorzien voor transcriptionele deactivering. DNMT3A katalyseert methylation van DNA die transcriptionele onderdrukking tijdens de vorming van heterochromatin op de endogene gene initiatiefnemers en andere regelgevende gebieden (figuur 1B)18,20 oefent. McDonald et al.18 en20 van de Vojta et al. waren de eerste auteurs om te melden dat methylation van DNA kan worden gebruikt voor epigenome-gen zwijgen of repressie, waaruit blijkt dat de plasmide-geleverd dCas9-DNMT3A fusiesysteem krachtiger kunt verbeteren Cytosine methylering rond de TSS18,20. McDonald en collega’s aangetoond dat de werkgelegenheid van de strategie kan leiden tot een aanzienlijke vermindering (ongeveer 40%) in een tumor suppressor gen niveaus CDKN2A mRNA18. Ook toont gericht op de regio unmethylated promotor van de BACH of IL6ST genen verhoogde CpG methylering die heeft zijn gecorreleerd met een dubbele afname de gen expressie20. Onze lab heeft onlangs het gebruik van methylation van DNA voor de pathologische uitkomsten van SNCA overexpressie (Figuur 2)23verzachtende voorzien. De strategie is gebaseerd op selectieve verbetering in methylation van DNA binnen de SNCA intron 1 regio, zoals het voorheen werd gerapporteerd als hypomethylated in PD en dementie met Lewy organen (DLB) hersenen24,25, 26. Deze hypomethylation is gekoppeld aan SNCA overexpressie, waardoor een aantrekkelijk doelwit voor therapeutische interventie24,27,28. We toonden onlangs een laag niveau van methylation van DNA in de SNCA intron 1 regio hiPSC afkomstige Dopaminerge NPC’s verkregen uit een PD-patiënt met de SNCA verdrievoudiging23. Het voordeel van deze experimentele model is dat de NPC’s kunnen krachtig in de cultuur doorgegeven of onderscheid gemaakt volwassen neuronen tussen, waardoor een efficiënte screening genetische factoren die cellulaire fenotypen bemiddelen, met inbegrip van oxidatieve te identificeren stress en apoptosis29. Dit modelsysteem maakt bovendien wetenschappers te recapituleren de ontwikkelingstoxiciteit gebeurtenissen die vóór aanvang van de symptomen in patiënten plaatsvonden. Daarnaast vertegenwoordigen hiPSC afkomstige NPC’s een geweldig hulpmiddel voor het testen van de trajecten van het cellulaire en moleculaire genexpressie is gekoppeld. Nog belangrijker is, kunnen hiPSC afkomstige NPC’s gecombineerd met state-of-the-art CRISPR/Cas9-epigenome technologie sterk bevordert de ontwikkeling van ‘next-generation drugs’ voor vele neurodegeneratieve ziekten.

Verklein pathologische niveaus van SNCA meningsuiting en ontwikkelden we onlangs een lentivirus gebaseerde systeem die een fusieproteïne dCas9-DNMT3A en gRNA tot specifiek doelwit CpG methylering binnen de SNCA intron 1 (figuur 2A)23. Dit protocol zal lentivirale vector (LV) ontwerp en productie in detail worden beschreven. LVs vertegenwoordigen een doeltreffend middel voor het leveren van CRISPR/dCas9 onderdelen voor verschillende redenen, namelijk (i) hun vermogen om te voeren omvangrijk DNA inserts, (ii) een hoog rendement van een breed scala van cellen, met inbegrip van zowel de nondividing als de scheidslijn cellen30 transducing , en (iii) hun vermogen voor het opwekken van minimale cytotoxische en immunogene reacties. Onlangs, we de LV-systeem toegepast op hiPSC afkomstige Dopaminerge neuronen van een patiënt met de verdrievoudiging van het SNCA locus en aangetoond dat het therapeutisch potentieel van LVs voor de levering van epigenome-bewerken methylering tools23 ( Figuur 2B). Inderdaad, een LV-gRNA/dCas9-DNMT3A-systeem zorgt ervoor dat een aanzienlijke toename in methylation van DNA op de SNCA intron 1 regio. Deze stijging komt overeen met de vermindering van de niveaus van SNCA mRNA en eiwit23. Bovendien redt SNCA Downregulatie PD-gerelateerde fenotypen in de SNCA verdrievoudiging/hiPSC-afgeleid Dopaminerge neuronen (bijvoorbeeld mitochondriale ROS productie en cel levensvatbaarheid)23. Nog belangrijker is, we laten zien dat de vermindering in SNCA expressie door de LV-gRNA-dCas9-DMNT3A-systeem geschikt is voor het omkeren van de fenotypen die kenmerkend voor hiPSC afkomstige Dopaminerge neuronen van een PD-patiënt die het droegen SNCA verdrievoudiging, zoals mitochondriale ROS productie en cel levensvatbaarheid23. Het doel van dit protocol is 1) te schetsen van het protocol van de productie en de concentratie van een geoptimaliseerde LV-platform voor het genereren van virale preparaten hoge-tittered en 2) voor het beschrijven van de differentiatie van hiPSCs naar NPC’s patroon om te worden volwassen Dopaminerge neuronen31,32 en de karakterisatie van de niveaus van de methylering van de gerichte regio binnen SNCA intron 1.

Lentivirale platformen hebben een groot voordeel ten opzichte van het meest populaire platform van de vector, namelijk adeno-geassocieerde vectoren (AAVs), die is van de eerstgenoemde mogelijkheid voor grotere genetische inzetstukken33,34. AAVs kan worden opgesteld tegen aanzienlijk hogere opbrengsten maar een lage verpakking capaciteit bezitten (< 4.8 kb), het gebruik ervan voor het leveren van alles-in-één CRISPR/Cas9 systemen in gevaar te brengen. Dus, lijkt het dat het LVs zou de platform-van-keuze in de toepassingen die betrokken zijn bij de levering van CRISPR/dCas9 hulpmiddelen. Het protocol hier geschetst zal dus een waardevol instrument voor onderzoekers verlangend te het effectief bewerken van epigenome componenten te leveren aan de cellen en organen. Het protocol verder schetst de strategie om te vergroten de mogelijkheden van het productie- en expressie van de vectoren via een wijziging in cis van de elementen in de vector expressie cassette30,35. De strategie is gebaseerd op de roman systeem ontwikkeld en studeerde in ons lab en wijst op haar vermogen om te produceren van virale deeltjes in de range van 1010 virale eenheden (VU) /mL30,35.

Protocol

1. de systeemontwerp en Virus productie Plasmide-ontwerp en constructieOpmerking: De bouw van een alles-in-één LV-gRNA-dCas9-DNMT3A-vector wordt uitgevoerd met behulp van een productie- en expressie expressie-geoptimaliseerde cassette gepubliceerd door Ortinski et al.30. De vector cassette draagt een herhaling van de site van de erkenning van de transcriptiefactor Sp1 en een state-of-the-art schrapping binnen de onvertaalde (U3′) een terminal 3′ du…

Representative Results

Validatie van de productie-titers van de vectoren van de LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro in tegenstelling tot de naïeve GFP tegenhanger Wij uitgevoerd p24gag ELISA te vergelijken tussen fysieke titers van LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro met de naïeve GFP/Puro tegenhangers. Representatieve resultaten, gepresenteerd in figuur 5A, tonen aan dat de fysieke opbrengsten van de vectoren, ge…

Discussion

LVs zijn begonnen te ontstaan als het voertuig van keuze voor het bewerken van epigenome, met name in het kader van genetische ziekten, vooral vanwege hun vermogen om (i) geschikt voor efficiënt transduce de grote DNA-nettoladingen en (ii) een breed scala van verdelen en nondividing cellen. De werkzaamheid van de grote verpakking van de LVs is vooral gunstig voor de toepassingen waarbij verpakking van de CRISPR/dCas9-systemen die zijn oversized. Vanuit dit perspectief vertegenwoordigen LVs de platform-of-choice voor de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de Kahn Neurotechnology Development Award (naar O.C.) en de nationale instituten van gezondheid/National Institute of Neurological Disorders en beroerte (NIH/NINDS) (R01 NS085011 aan O.C.).

Materials

Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
6-well plates Corning 3516
Aggrewell 800 StemCell Technologies 34811
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
BD FACS Becton Dickinson 338960
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
Eppendorf Cell Imaging Slides Eppendorf 30742060
High-binding 96-well plates Corning 3366
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Reversible Strainer StemCell Technologies 27215
SW32Ti rotor Beckman Coulter 369650
VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic VWR 93000-694
VWR® Vacuum Filtration Systems VWR 89220-694
xMark™ Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
Accutase StemCell Technologies 7920
Anti-Adherence Rinsing Solution StemCell Technologies 7010
Anti-FOXA2 Antibody Abcam Ab60721
Anti-Nestin Antibody Abcam Ab18102
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587010
BES Sigma Aldrich B9879 – BES
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260037
CHIR99021 StemCell Technologies 72052
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 08-774-552
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
DMEM-F12 Lonza 12-719
DMEM, high glucose media Gibco 11965
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EpiTect PCR Control DNA Set Qiagen 596945
EZ DNA Methylation Kit Zymo Research D5001
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15750078
Gentle Cell Dissociation Reagent stemCell Technologies 7174
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Human Recombinant bFGF StemCell Technologies 78003
Human Recombinant EGF StemCell Technologies 78006
Human Recombinant Shh (C24II) StemCell Technologies 78065
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140050
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502001
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
PyroMark PCR Kit Qiagen 978703
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
SB431542 StemCell Technologies 72232
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
STEMdiff Neural Induction Medium StemCell Technologies 5835
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium StemCell Technologies 5838
TaqMan Assay FOXA2 Thermo Fisher Scientific Hs00232764
TaqMan Assay GAPDH Thermo Fisher Scientific Hs99999905
TaqMan Assay Nestin Thermo Fisher Scientific Hs04187831
TaqMan Assay OCT4 Thermo Fisher Scientific Hs04260367
TaqMan Assay PPIA Thermo Fisher Scientific Hs99999904
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
Y27632 StemCell Technologies 72302
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pMD2.G Addgene 12253
pRSV-Rev Addgene 52961
psPAX2 Addgene 12259
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsmBI New England Biolabs R0580S
BsrGI New England Biolabs R0575S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

References

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation. Nature Methods. 13 (2), 127-137 (2016).
  4. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  5. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  6. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  7. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  8. Horlbeck, M. A., et al. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. eLife. 5, (2016).
  9. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  10. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  13. Holtzman, L., Gersbach, C. A. Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape. Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).
  14. Perez-Pinera, P., et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).
  15. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  16. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).
  17. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  18. McDonald, J. I., et al. Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).
  19. Huang, Y. H., et al. DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A. Genome Biology. 18 (1), 176 (2017).
  20. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  21. Razin, A., Kantor, B. DNA methylation in epigenetic control of gene expression. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).
  22. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  23. Kantor, B., et al. Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD. Molecular Therapy. , (2018).
  24. Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson’s disease patients’ brains. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).
  25. Wang, Y., et al. A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2′-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson’s disease-related genes in dopaminergic neurons. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).
  26. Matsumoto, L., et al. CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson’s disease. PLOS One. 5 (11), e15522 (2010).
  27. Desplats, P., et al. Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases. Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).
  28. Ai, S. X., et al. Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson’s disease. Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).
  29. Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies. Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).
  30. Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).
  31. Tagliafierro, L., et al. Genetic analysis of alpha-synuclein 3′ untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson’s disease compared to dementia with Lewy bodies. Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).
  32. Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging. Human Molecular Genetics. , (2018).
  33. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical applications involving CNS gene transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  34. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  35. Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56915 (2017).
  36. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  37. Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. Bisulfite pyrosequencing. Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).
  38. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  39. Nishimasu, H., et al. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
  40. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  41. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  42. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  43. Goffin, V., et al. Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).
  44. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  45. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).

Play Video

Cite This Article
Tagliafierro, L., Ilich, E., Moncalvo, M., Gu, J., Sriskanda, A., Grenier, C., Murphy, S. K., Chiba-Falek, O., Kantor, B. Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models. J. Vis. Exp. (145), e59241, doi:10.3791/59241 (2019).

View Video