Summary

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

Published: July 24, 2019
doi:

Summary

L’obiettivo di questo protocollo è descrivere un approccio per l’analisi del comportamento delle cellule staminali/progenitrici neurali adulte in risposta alla manipolazione chemiogenetica di uno specifico circuito neurale locale.

Abstract

La neurogenesi adulta è un processo dinamico mediante il quale le cellule staminali neurali appena attivate (NSC) nella zona subgranulare (SG) del giro dentato (DG) generano nuovi neuroni, che si integrano in un circuito neurale esistente e contribuiscono a specifiche funzioni ippocampali . È importante sottolineare che la neurogenesi adulta è altamente suscettibile agli stimoli ambientali, che consente la regolazione dipendente dall’attività di varie funzioni cognitive. Una vasta gamma di circuiti neurali provenienti da varie regioni del cervello orchestra queste funzioni cognitive complesse. È quindi importante capire come specifici circuiti neurali regolano la neurogenesi adulta. Qui, descriviamo un protocollo per manipolare l’attività del circuito neurale utilizzando il recettore del designer attivato esclusivamente dalla tecnologia dei farmaci di design (DREADDs) che regola le NSC e la progenie neonatale nei roditori. Questo protocollo completo include l’iniezione stereotassica di particelle virali, la stimolazione chemiogenetica di specifici circuiti neurali, la somministrazione analogica della tiofina, l’elaborazione dei tessuti, l’etichettatura dell’immunofluorescenza, l’imaging confocale e l’imaging analisi di varie fasi delle cellule precursori neurali. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate sulle tecniche di recupero degli antigeni utilizzate per visualizzare le NSC e la loro progenie e descrive un modo semplice, ma efficace per modulare i circuiti cerebrali utilizzando clozapina N-ossido (CNO) o acqua potabile contenente CNO e DREADDs-esprimere virus. La forza di questo protocollo sta nella sua adattabilità per studiare una vasta gamma di circuiti neurali che influenzano la neurogenesi adulta derivata dalle NSC.

Introduction

La neurogenesi adulta è un processo biologico attraverso il quale nuovi neuroni nascono in un adulto e integrati nelle reti neurali esistenti1. Nell’uomo, questo processo si verifica nel giro dentato (DG) dell’ippocampo, dove nascono circa 1.400 nuove cellule ogni giorno2. Queste cellule risiedono nella parte interna della DG, che ospita una nicchia neurogenica, definita zona subgranulare (SG. Qui, ippocampal adulti cellule staminali neurali (NSC) subiscono un complesso processo di sviluppo per diventare neuroni completamente funzionali che contribuiscono alla regolazione di specifiche funzioni cerebrali, tra cui apprendimento e memoria, regolazione dell’umore, e la risposta allo stress3 ,4,5,6. Per influenzare i comportamenti, le NSC adulte sono altamente regolate da vari stimoli esterni in modo dipendente dall’attività rispondendo a una serie di segnali chimici locali e distale. Questi segnali chimici includono neurotrasmettitori e neuromodulatori e agiscono in modo specifico del circuito da varie regioni del cervello. È importante sottolineare che la convergenza su circuiti di questi segnali chimici sulle NSC consente una regolazione unica e precisa dell’attivazione delle cellule staminali, della differenziazione e delle decisioni sul destino.

Uno dei modi più efficaci per interrogare la regolazione dei circuiti delle NSC adulte in vivo è associare l’analisi dell’immunofluorescenza con manipolazioni a livello di circuito. L’analisi dell’immunofluorescenza delle NSC adulte è una tecnica comunemente utilizzata, in cui gli anticorpi contro specifici marcatori molecolari vengono utilizzati per indicare lo stadio di sviluppo delle NSC adulte. Questi marcatori includono: nestina come una cellula radiale glia e marcatore progenitore precoce, Tbr2 come marcatore progenitore intermedio, e dcx come un marcatore neurone neuroblast e immaturo7. Inoltre, somministrando analoghi di tiofina come BrdU, CidU, Idu ed Edu, le popolazioni cellulari in fase S possono essere etichettate individualmente e visualizzate8,9,10. Combinando questi due approcci, è possibile studiare una vasta gamma di domande che vanno dal modo in cui la proliferazione è regolata in fasi di sviluppo specifiche, al modo in cui i vari segnali influenzano la differenziazione e la neurogenesi della NSC.

Esistono diverse opzioni per manipolare efficacemente i circuiti neurali, tra cui la stimolazione elettrica, l’optogenetica e la chemiogenetica, ognuna con i propri vantaggi e svantaggi. La stimolazione elettrica comporta un’estesa chirurgia in cui gli elettrodi vengono impiantati in una regione cerebrale specifica che vengono successivamente utilizzati per trasmettere segnali elettrici per modulare una regione cerebrale mirata. Tuttavia, questo approccio manca sia di specificità cellulare che di circuito. L’optogenetica comporta la consegna di particelle virali che codificano un recettore attivo alla luce che viene stimolato da un laser emesso attraverso una fibra ottica impiantata, ma richiede ampie manipolazioni, costi generali e interventi chirurgici complessi11. La chemiogenetica comporta la consegna di particelle virali che codificano un recettore di design attivato esclusivamente da farmaci di design o DREADD, che vengono successivamente attivati da un ligando specifico e biologicamente inerte noto come clozapina N-ossido (CNO)12 . Il vantaggio di utilizzare dREADD per manipolare i circuiti neurali locali che regolano le NSC adulte sta nella facilità e nelle varie rotte dell’amministrazione CNO. Ciò consente un approccio meno dispendioso in termini di tempo con una gestione ridotta degli animali, facilmente adattabile per studi a lungo termine per modulare i circuiti neurali.

L’approccio descritto in questo protocollo è una raccolta completa di vari protocolli necessari per interrogare con successo la regolazione del circuito della neurogenesi ippocampale adulta che combina sia tecniche di immunofluorescenza che manipolazioni di circuiti usando la chemiogenetica. Il metodo descritto nel seguente protocollo è appropriato per stimolare o inibire uno o più circuiti contemporaneamente in vivo per determinare la loro funzione regolatoria sulla neurogenesi adulta. Questo approccio è meglio utilizzato se la domanda non ha bisogno di un alto grado di risoluzione temporale. Le domande che richiedono un controllo temporale preciso della stimolazione/inibizione ad una certa frequenza, possono essere affrontate meglio utilizzando l’optogenetica13,14. L’approccio qui descritto è facilmente adattabile per studi a lungo termine con una minima manipolazione animale, soprattutto quando lo stress è una delle principali preoccupazioni.

Protocol

Tutte le procedure, inclusi i soggetti animali, sono state approvate dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell’Università della Carolina del Nord Chapel Hill. 1. Iniezione stereotassica di particelle virali Determinare i circuiti neurali in questione. Questo determinerà il virus e la linea del mouse utilizzato per la seguente procedura. NOT:</ Per questo esempio, le proiezioni delle cellule muschio contralaterale vengono stimolate ad analizzare …

Representative Results

Seguendo le procedure sperimentali descritte sopra (Figura 1A,B), siamo stati in grado di determinare gli effetti di stimolare le proiezioni delle cellule muschio contralaterali sulla nicchia neurogenica all’interno dell’ippocampo. Utilizzando un virus DREADD stimolante accoppiato con un’etichettatura 5-HT2A Cre-line di cellule muschio dipendente dalla Creci, siamo stati in grado di attivare selettivamente proiezioni eccitatori da cellule muschiate sulla DG contralaterale e …

Discussion

L’obiettivo di questo protocollo è quello di valutare come la manipolazione di circuiti neurali specifici regola la neurogenesi ippocampale adulta in vivo utilizzando una serie di tecniche di immunoistochimica. Affermare che la regolazione dipendente dall’attività della neurogenesi adulta mediata da specifici circuiti neurali è una tecnica preziosa con un grande potenziale di modifiche per studiare una gamma diversificata di circuiti neurali. Il successo di questi tipi di esperimenti dipende da molteplici fattori tra …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L.J.Q. è stato sostenuto dal National Institute of Mental Health dei National Institutes of Health sotto il Supplemento sulla Diversità R01MH111773 e da una sovvenzione di formazione T32NS007431-20. Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni concesse a J.S. da NIH (MH111773, AG058160 e NS104530).

Materials

24 Well Plate Thermo Fisher Scientific 07-200-84
48 Well Plate Denville Scientific T1049
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) Carbosynth NE08701
Alcohol 70% Isopropyl Thermo Fisher Scientific 64-17-5
Alcohol Prep Pads Thermo Fisher Scientific 13-680-63
Alexa-488 Azide Thermo Fisher Scientific A10266
Anti-Chicken Nestin Aves NES; RRID: AB_2314882
Anti-Goat DCX Santa Cruz Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494
Anti-Mouse Tbr2 Thermo Fisher Scientific 14-4875-82; RRID: AB_11042577
Betadine Solution (povidone-iodine) Amazon
Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) Sigma-Aldrich 251275
Clozapine N- Oxide Sigma-Aldrich C08352-5MG
Confocal Software (Zen Black) Zeiss Microscopy Zen 2.3 SP1 FP1 (black)
Copper (II) Sulfate Pentahydrate Thermo Fisher Scientific AC197722500
Cotton Swabs Amazon
Coverslip Denville Scientific M1100-02
Delicate Task Wipe Kimwipes Kimtech Science 7557
Drill Bit .5mm Fine Science Tools 19007-05
Ethylene Glycol Thermo Fisher Scientific E178-1
Hamilton Needle 2 inch Hmailton Company 7803-05
Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN Hmailton Company Ref: 87931
High Speed Drill Foredom 1474
Infusion Pump Harvard Apparatus 70-4511
Injectable Saline Solution Mountainside Health Care NDC 0409-4888-20
Insulin Syringe BD Ultra-Fine Insulin Syringes
Isoflurane Henry Schein 29405
Stereotax For Small Animal KOPF Instruments Model 942
Leica M80 Leica
Leica Microtome Leica SM2010 R
LSM 780 Zeiss Microscopy
Nair (Hair Removal Product) Nair
Paraformaldahyde 4% Sigma-Aldrich 158127
Plus Charged Slide Denville Scientific M1021
Phosphate Buffered Solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010031
Puralube Vet Ointment Puralube
Slide Rack 20 slide unit Electron Microscopy Science 70312-24
Slide Rack holder Electron Microscopy Science 70312-25
Small Animal Heating Pad K&H
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Super PAP Pen 4 mm tip PolySciences 24230
Surgical Scalpel MedPride 47121
Tris Buffered Solution (TBS) Sigma-Aldrich T5912
Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) Sigma-Aldrich C8532
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Tweezers Amazon
Vet Bond Tissue Adhesive 3M 1469SB

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Cite This Article
Quintanilla, L. J., Yeh, C., Bao, H., Catavero, C., Song, J. Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells. J. Vis. Exp. (149), e59237, doi:10.3791/59237 (2019).

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