Summary

Assaying Circuit Spezifische Regulation von adulthippocampal neuralen Vorläuferzellen

Published: July 24, 2019
doi:

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen Ansatz zur Analyse des Verhaltens von adulten neuronalen Stamm-/Vorläuferzellen als Reaktion auf die chemogenetische Manipulation eines bestimmten lokalen neuronalen Schaltkreises zu beschreiben.

Abstract

Die adulte Neurogenese ist ein dynamischer Prozess, bei dem neu aktivierte neuronale Stammzellen (NSCs) in der subgranularen Zone (SGZ) des Dentatgyrus (DG) neue Neuronen erzeugen, die sich in einen bestehenden neuronalen Kreislauf integrieren und zu spezifischen Hippocampusfunktionen beitragen. . Wichtig ist, dass die adulte Neurogenese sehr anfällig für Umweltreize ist, die eine aktivitätsabhängige Regulierung verschiedener kognitiver Funktionen ermöglichen. Eine breite Palette von neuronalen Schaltkreisen aus verschiedenen Gehirnregionen orchestriert diese komplexen kognitiven Funktionen. Es ist daher wichtig zu verstehen, wie bestimmte neuronale Schaltkreise die Adult Neurogenese regulieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Manipulation der Aktivität neuronaler Schaltkreise mit Designerrezeptoren, die ausschließlich durch Designer-Medikamente (DREADDs) Technologie aktiviert werden, die NSCs und neugeborene Nachkommen bei Nagetieren reguliert. Dieses umfassende Protokoll umfasst die stereotaxic-Injektion von Viruspartikeln, die chemogenetische Stimulation bestimmter neuronaler Schaltkreise, die analoge Verabreichung von Thymidin, die Gewebeverarbeitung, die Immunfluoreszenzkennzeichnung, die konfokale Bildgebung und die Bildgebung. Analyse verschiedener Stadien neuronaler Vorläuferzellen. Dieses Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zu Antigen-Retrieval-Techniken zur Visualisierung von NSCs und deren Nachkommen und beschreibt eine einfache, aber effektive Möglichkeit, Gehirnkreise mit Clozapin-N-Oxid (CNO) oder CNO-haltigem Trinkwasser zu modulieren und DREADDs-exzierende Viren. Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Anpassungsfähigkeit, eine Vielzahl von neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen, die die von NSCs abgeleitete Adult Neurogenese beeinflussen.

Introduction

Adult Neurogenesis ist ein biologischer Prozess, durch den neue Neuronen in einem Erwachsenen geboren und in die bestehenden neuronalen Netzwerke integriert werden1. Beim Menschen findet dieser Prozess im Dentate Gyrus (DG) des Hippocampus statt, wo täglich etwa 1.400 neue Zellen geboren werden2. Diese Zellen befinden sich im inneren Teil der DG, der eine neurogene Nische, die so genannte subgranulare Zone (SGZ), beherbergt. Hier durchlaufen hippocampale adulte neuronale Stammzellen (NSCs) einen komplexen Entwicklungsprozess, um voll funktionsfähige Neuronen zu werden, die zur Regulierung spezifischer Gehirnfunktionen beitragen, einschließlich Lernen und Gedächtnis, Stimmungsregulierung und Stressreaktion3 ,4,5,6. Um das Verhalten zu beeinflussen, werden erwachsene NSCs durch verschiedene externe Reize in einer aktivitätsabhängigen Weise stark reguliert, indem sie auf eine Reihe lokaler und distaler chemischer Hinweise reagieren. Diese chemischen Hinweise umfassen Neurotransmitter und Neuromodulatoren und handeln in einer Schaltung spezifische Weise aus verschiedenen Gehirnregionen. Wichtig ist, dass die kreisweite Konvergenz dieser chemischen Hinweise auf NSCs eine einzigartige und präzise Regulierung von Stammzellaktivierungs-, Differenzierungs- und Schicksalsentscheidungen ermöglicht.

Eine der effektivsten Möglichkeiten, die Schaltungsregulierung von erwachsenen NSCs in vivo abzuhören, besteht darin, die Immunfluoreszenzanalyse mit kreisweiten Manipulationen zu koppeln. Die Immunfluoreszenzanalyse von nSCs für Erwachsene ist eine häufig verwendete Technik, bei der Antikörper gegen bestimmte molekulare Marker verwendet werden, um das Entwicklungsstadium von nSCs für Erwachsene anzuzeigen. Zu diesen Markern gehören: Nestin als radiale Gliazelle und früher neuronaler Vorläufermarker, Tbr2 als zwischengeschalteter Vorläufermarker und dcx als Neuroblast und unreifer Neuronenmarker7. Zusätzlich können durch die Verabreichung von Thymidin-Analogen wie BrdU, CidU, Idu und Edu Zellpopulationen, die sich der S-Phase unterziehen, individuell beschriftet und visualisiert werden8,9,10. Durch die Kombination dieser beiden Ansätze kann eine breite Palette von Fragen untersucht werden, die von der Art und Weise, wie die Proliferation in bestimmten Entwicklungsstadien reguliert wird, bis hin zur Wirkung verschiedener Hinweise auf die NSC-Differenzierung und Neurogenese reichen.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, neuronale Schaltkreise effektiv zu manipulieren, einschließlich elektrischer Stimulation, Optogenetik und Chemogenetik, jeder mit seinen eigenen Vor- und Nachteilen. Die elektrische Stimulation beinhaltet eine umfangreiche Operation, bei der Elektroden in eine bestimmte Hirnregion implantiert werden, die später verwendet werden, um elektrische Signale zu übertragen, um eine zielgerichtete Hirnregion zu modulieren. Dieser Ansatz fehlt jedoch sowohl der zellulären als auch der Schaltungssspezifität. Optogenetik beinhaltet die Lieferung von viralen Partikeln, die einen Licht-aktivierten Rezeptor kodieren, der durch einen Laser stimuliert wird, der durch eine implantierte optische Faser emittiert wird, aber umfangreiche Manipulationen, hohe Kosten und komplexe Operationen erfordert11. Chemogenetik beinhaltet die Abgabe von Viruspartikeln, die einen Designerrezeptor kodieren, der ausschließlich durch Designermedikamente oder DREADDs aktiviert wird, die anschließend durch einen spezifischen und biologisch inerten Liganden, bekannt als Clozapin-N-Oxid (CNO)12, aktiviert werden. . Der Vorteil der Verwendung von DREADDs zur Manipulation lokaler neuronaler Schaltkreise, die erwachsene NSCs regulieren, liegt in der Leichtigkeit und den verschiedenen Wegen der CNO-Administration. Dies ermöglicht einen weniger zeitaufwändigen Ansatz mit reduzierter Tierhandhabung, der für Langzeitstudien leicht anpassungsfähig ist, um neuronale Schaltkreise zu modulieren.

Der in diesem Protokoll beschriebene Ansatz ist eine umfassende Sammlung verschiedener Protokolle, die erforderlich sind, um die Schaltkreisregulierung der erwachsenen Hippocampus-Neurogenese erfolgreich abzuhören, die sowohl Immunfluoreszenztechniken als auch Schaltungsmanipulationen kombiniert. Chemogenetik. Die im folgenden Protokoll beschriebene Methode eignet sich zur Stimulierung oder Hemmung eines oder mehrerer Schaltkreise gleichzeitig in vivo, um ihre regulatorische Funktion auf die adulte Neurogenese zu bestimmen. Dieser Ansatz wird am besten verwendet, wenn die Frage nicht ein hohes Maß an zeitlicher Auflösung benötigt. Fragen, die eine präzise zeitliche Kontrolle der Stimulation/Hemmung bei einer bestimmten Frequenz erfordern, können besser mit der Optogenetik13,14behandelt werden. Der hier beschriebene Ansatz ist leicht für Langzeitstudien mit minimalem Umgang mit Tieren geeignet, insbesondere dort, wo Stress ein großes Anliegen ist.

Protocol

Alle Verfahren einschließlich tierischer Fächer wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of North Carolina Chapel Hill genehmigt. 1. Stereotaxic Injektion von Viralpartikeln Bestimmen Sie die betreffenden neuronalen Schaltkreise. Dadurch wird der Virus und die Mauslinie für das folgende Verfahren verwendet bestimmt.HINWEIS: Für dieses Beispiel werden kontralaterale Mooszellprojektionen stimuliert, um seine Auswirkungen …

Representative Results

Nach den oben beschriebenen experimentellen Verfahren (Abbildung 1A,B) konnten wir die Auswirkungen der Stimulierung kontralateraler Mooszellprojektionen auf die neurogene Nische innerhalb des Hippocampus bestimmen. Durch die Verwendung eines cre-abhängigen Gq-gekoppelten stimulierenden DREADD-Virus gepaart mit einer moosigen Zelle mit der Bezeichnung 5-HT2A Cre-line konnten wir selektiv exzitatorische Projektionen von moosigen Zellen auf die kontralaterale DG aktivieren un…

Discussion

Das Ziel dieses Protokolls ist es zu beurteilen, wie die Manipulation bestimmter neuronaler Schaltkreise die adulte Hippocampus-Neurogenese in vivo mit einer Reihe von Immunhistochemie-Techniken reguliert. Die aktivitätsabhängige Regulation der adulten Neurogenese, die durch bestimmte neuronale Schaltkreise vermittelt wird, ist eine wertvolle Technik mit großem Potenzial für Modifikationen, um eine Vielzahl von neuronalen Schaltkreisen zu untersuchen. Der Erfolg dieser Arten von Experimenten hängt von mehreren Fakto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

L.J.Q. wurde vom National Institute of Mental Health der National Institutes of Health unter Diversity Supplement R01MH111773 sowie einem T32-Ausbildungsstipendium T32NS007431-20 unterstützt. Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse unterstützt, die J.S. von NIH (MH111773, AG058160 und NS104530) gewährt wurden.

Materials

24 Well Plate Thermo Fisher Scientific 07-200-84
48 Well Plate Denville Scientific T1049
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) Carbosynth NE08701
Alcohol 70% Isopropyl Thermo Fisher Scientific 64-17-5
Alcohol Prep Pads Thermo Fisher Scientific 13-680-63
Alexa-488 Azide Thermo Fisher Scientific A10266
Anti-Chicken Nestin Aves NES; RRID: AB_2314882
Anti-Goat DCX Santa Cruz Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494
Anti-Mouse Tbr2 Thermo Fisher Scientific 14-4875-82; RRID: AB_11042577
Betadine Solution (povidone-iodine) Amazon
Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) Sigma-Aldrich 251275
Clozapine N- Oxide Sigma-Aldrich C08352-5MG
Confocal Software (Zen Black) Zeiss Microscopy Zen 2.3 SP1 FP1 (black)
Copper (II) Sulfate Pentahydrate Thermo Fisher Scientific AC197722500
Cotton Swabs Amazon
Coverslip Denville Scientific M1100-02
Delicate Task Wipe Kimwipes Kimtech Science 7557
Drill Bit .5mm Fine Science Tools 19007-05
Ethylene Glycol Thermo Fisher Scientific E178-1
Hamilton Needle 2 inch Hmailton Company 7803-05
Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN Hmailton Company Ref: 87931
High Speed Drill Foredom 1474
Infusion Pump Harvard Apparatus 70-4511
Injectable Saline Solution Mountainside Health Care NDC 0409-4888-20
Insulin Syringe BD Ultra-Fine Insulin Syringes
Isoflurane Henry Schein 29405
Stereotax For Small Animal KOPF Instruments Model 942
Leica M80 Leica
Leica Microtome Leica SM2010 R
LSM 780 Zeiss Microscopy
Nair (Hair Removal Product) Nair
Paraformaldahyde 4% Sigma-Aldrich 158127
Plus Charged Slide Denville Scientific M1021
Phosphate Buffered Solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010031
Puralube Vet Ointment Puralube
Slide Rack 20 slide unit Electron Microscopy Science 70312-24
Slide Rack holder Electron Microscopy Science 70312-25
Small Animal Heating Pad K&H
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Super PAP Pen 4 mm tip PolySciences 24230
Surgical Scalpel MedPride 47121
Tris Buffered Solution (TBS) Sigma-Aldrich T5912
Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) Sigma-Aldrich C8532
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Tweezers Amazon
Vet Bond Tissue Adhesive 3M 1469SB

References

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Cite This Article
Quintanilla, L. J., Yeh, C., Bao, H., Catavero, C., Song, J. Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells. J. Vis. Exp. (149), e59237, doi:10.3791/59237 (2019).

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