הדמיית פלורסנט של מנגו-מתויג RNA ב-Pvc פוליאקרילאמיד באמצעות שיטת Poststaining
Summary
כאן אנו מציגים רגיש, מהיר, ומפלה שיטת להפלות מכתים את התמונה rnas מתויג עם ה-RNA מנגו aptamers I, II, III, או IV, באמצעות מקורי או באמצעות הרפתקאות אלקטרופורזה ג’ל אלקטרופורזה (PAGE) ג’לים. לאחר הפעלת ג’לים סטנדרטיים של דף, מנגו-מתויג RNA יכול להיות מוכתם בקלות עם TO1-Biotin ולאחר מכן ניתח באמצעות קוראי קרינה זמינים נפוץ.
Abstract
באופן שגרתי ובאמצעות ג’ל פוליאקרילמיד משמשים לאפיון מורכבות של ריבונאופלפרוטאין (RNP) ולמדידת גודל RNA, בהתאמה. כמו שיטות רבות של הדמיה ג’ל להשתמש כתמים לא ספציפיים או בדיקה fluorophore יקר, רגיש, להפלות, ומתודולוגיות הדמיה חסכונית-ג’ל הם רצויים מאוד. RNA רצפי הליבה של מנגו הם קטנים (19-22 nt) רצף מוטיבים כי, כאשר נסגר על ידי גזע שרירותי RNA, יכול להיות פשוט ובזול מצורף ל-RNA של עניין. אלה תגי מנגו לאגד עם אהדה גבוהה וספציפיות thiazole-כתום fluorophore ליגיום הנקרא TO1-Biotin, אשר הופך אלפי פעמים פלורסנט יותר על הכריכה. כאן אנו מראים כי מנגו I, II, III, ו IV יכול לשמש במיוחד בתמונה RNA ב ג’לים עם רגישות גבוהה. קצת כמו 62.5 fmol של RNA ב ג’לים מקומיים ו 125 fmol של RNA בג הרפתקאות ניתן להבחין על ידי ג’ל הטבילה במאגר דימות המכיל אשלגן ו 20 ננומטר TO1-Biotin עבור 30 דקות. אנו להדגים את הספציפיות של מנגו מערכת מתויגים על ידי דימות מנגו-שתייגת ה-RNA בקטריאלי של 6S בהקשר של תערובת מורכבת של רנ א חיידקי הכולל.
Introduction
מנגו הוא מערכת תיוג RNA המורכב מסדרה של ארבעה RNA פלורסנט קטנים aptamers לאגד בחוזקה (כריכת nanomolar) כדי נגזרות פשוטות של thiazole-כתום (TO1-Biotin, איור 1A)1,2,3 . עם הכריכה, הקרינה הפלואורסצנטית של זה הוא גדל 1,000-to 4,000-לקפל בהתאם לאפאלף המסוים. בהירות גבוהה של מערכת מנגו, אשר עבור מנגו III עולה על זה של חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP), בשילוב עם הזיקה של האיגוד nanomolar של ה-RNA מנגו aptamers, מאפשר לו לשמש הן הדמיה וטיהור של RNA תסביכים2,4.
רנטגן מבנים של מנגו אני5, השני6, ו III7 היו נחושים ברזולוציה גבוהה, וכל שלושת Aptamers לנצל את ה-RNA 4 מ א כדי לאגד TO1-biotin (איור 1b– D). הליבות הקומפקטיות של כל שלושת האפתמים מבודדים מרצף ה-RNA החיצוני באמצעות מוטיבים מתאם קומפקטיים. מנגו I ו-II לנצל מתאם גמישה GNRA כמו לולאה כדי לחבר את ליבות מנגו שלהם לדופלקס RNA שרירותי (איור 1B, C). לעומת זאת, מנגו השלישי משתמש מוטיב טריפלקס נוקשה לחבר את הליבה שלה סליל RNA שרירותי (איור 1D, שאריות סגולים), בעוד המבנה של מנגו IV אינו ידוע כעת. כמו הליבה ליגולי מחייב של כל אחד מהאפתמים האלה מופרד מרצף ה-RNA החיצוני על ידי המתאמים הללו, נראה כי הם יכולים להיות פשוט שולבו מגוון של RNAs. ה-rna התלת-ממדי של החיידק (מנגו i), הרכיבים של השמרים מלצונים (מנגו i), ו-rna 5s, U6 rna, ו-C/D scarna (מנגו II ו IV) כל היתה בהצלחה מתויג באופנה2,8, הרומז כי רבים RNAs ביולוגי יכול להיות מתויג באמצעות RNA מנגו מערכת aptamer.
הרפתקאות מקורי וג משמשים בדרך כלל כדי ללמוד RNAs. ג’לים משומשים משמשים לעתים קרובות כדי לשפוט את הגודל או העיבוד של RNA, אבל בדרך כלל, במקרה של כתם בצפון, למשל, דורשים מספר שלבים איטיים ורציפים כדי ליצור תמונה. בעוד כאשר ה-RNA fluorogenic אחרים, כמו תרד RNA וברוקולי, כבר נעשה שימוש בהצלחה עבור הדמיה ג’ל9, אין מערכת apers fluorogenic עד היום בעל בהירות גבוהה ואהדה של מערכת מנגו, מה שהופך אותו עניין רב לחקור יכולות הדמיה ג’ל של מנגו. במחקר זה, תהינו אם מערכת ה-RNA מנגו יכול להיות פשוט מורחב ג’ל הדמיה, כמו עירור אורכי גל פליטה של TO1-Biotin (510 nm ו 535 nm, בהתאמה) מתאימים הדמיה בערוץ eGFP משותף הפלורסנט ביותר מכשור סריקת ג’ל.
הפרוטוקול שלאחר ג’ל מכתים הציג כאן מספק דרך מהירה במיוחד לזהות מנגו מתויגות מולקולות RNA ב מקורי והרפתקאות אלקטרופורזה ג’ל אלקטרופורזה (PAGE) ג’לים. זו שיטת הצביעת כוללת ג’ל לטבילה במאגר המכיל אשלגן ו-TO1-Biotin. רנ א מנגו aptamers הם G-ארבעה מבוססי plex ו אשלגן נדרש כדי לייצב מבנים כאלה. באמצעות RNA ששועתק מ מינימלי קידוד מנגו תבניות DNA (לראות את מדור הפרוטוקול), אנחנו יכולים פשוט לזהות מעט ככל 62.5 fmol של RNA ב ג’לים מקומיים ו 125 fmol של RNA ב-הרפתקאות ג ‘ לים, באמצעות פרוטוקול מכתים ישירה. בניגוד לכתמי חומצות גרעין לא ספציפיות (ראה טבלת חומרים, המכונה SG מכאן), אנחנו יכולים לזהות בבירור מנגו-rna מתויג גם כאשר ריכוזים גבוהים של רנ א מתויג סך קיימים במדגם.
Protocol
Representative Results
Discussion
יתרון משמעותי של תג פלורסנט מנגו הוא תג אחד ניתן להשתמש בדרכים מרובות. בהירות גבוהה ואהדה של aptamers אלה להפוך אותם שימושיים לא רק עבור הדמיית תא2 אלא גם עבור מחוץ גופית RNA או rnp טיהור4. לכן, הדמיה ג’ל מרחיב את רב-תכליתיות תג מנגו בצורה פשוטה. רגישות מנגו ג’ל הדמיה היא מעט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לרזון קוג’ואו ואמיר אבדולאזדה על הסיוע הטכני שלהם ועל לנה דולגושינה על הגהה של כתב היד. המימון סופק עבור פרויקט זה על ידי מדעי הטבע הקנדי ומועצת המחקר ההנדסה (NSERC) מענק הפעלה P.J.U.
Materials
| 0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels | LabRepCo | 11956042 | |
| 101-1000 µL tips | Fisher | 02-707-511 | |
| 20-200 µL low retention tips | Fisher Scientific | 02-717-143 | |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) | Bioreagents | BP1406-1 | Acute toxicity |
| Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) | Fisher | BP1408-1 | Acute toxicity |
| Agar | Anachemia | 02116-380 | |
| Aluminium backed TLC plate | Sigma-Aldrich | 1164840001 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare Lifesciences | 29083461 | |
| Ammonium Persulfate | Biorad | 161-0700 | Harmful |
| BL21 cells | NEB | C2527H | |
| Boric Acid | ACP | B-2940 | |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma | B8026-25G | |
| Chloloform | ACP | C3300 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich Alcohols | D0632-5G | |
| DNase I | ThermoFisher | EN0525 | |
| EDTA Disodium Salt | ACP | E-4320 | |
| Ethanol | Commerial | P016EAAN | |
| Flat Gel Loading tips | Costar | CS004854 | |
| Formamide 99% | Alfa Aesar | A11076 | |
| Gel apparatus set with spacers and combs | LabRepCo | 41077017 | |
| Glass Dish with Plastic lid | Pyrex | 1122963 | Should be large enough to fit your gel piece |
| Glycerol | Anachemia | 43567-540 | |
| HCl | Anachemia | 464140468 | |
| ImageQuanTL | GE Healthcare Lifesciences | 29000605 | |
| IPTG | Invitrogen | 15529-019 | |
| KCl | ACP | P-2940 | |
| MgCl2 | Caledron | 4903-01 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M3409 | |
| NaCl | ACP | S-2830 | |
| NaOH | BDH | BDH9292 | |
| Orbital Rotator | Lab-Line | ||
| Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| Round Gel Loading tips | Costar | CS004853 | |
| Sodium Phosphate dibasic | Caledron | 8120-1 | |
| Sodium Phosphate monobasic | Caledron | 8180-01 | |
| SYBRGold | ThermoFisher | S11494 | |
| T7 RNA Polymerase | ABM | E041 | |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024-50 ml | |
| TO1-3PEG-Biotin Fluorophore | ABM | G955 | |
| Tris Base | Fisher | BP152-500 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Tween-20 | Sigma | P9496-100 | |
| Urea | Fisher | U15-3 | |
| Xylene Cyanol | Sigma | X4126-10G | |
| Yeast Extract | Bioshop | YEX401.500 |
References
- Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
- Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
- Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
- Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
- Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. 生物化学. 57, 3544-3548 (2018).
- Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , (2018).
- Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
- Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
- Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
- A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018)
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
- Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).
