Gavage를 사용 하 여 신생아 쥐에 있는 Probiotic 연구

동물 케어 시설 브리티시 컬럼비아의 대학에 지원 담당자에 의해 설립 지침에 관한 모든 절차 실행 되었다 및 모든 절차 UBC 동물 관리 위원회에 의해 승인 했다. 1. 관리 하는 probiotics의 정량화 참고:이 단계 probiotic 단 하나의 복용량에서 관리 될 수 있는 CFU의 정확한 금액을 결정 하는 것이 좋습니다. Probiotics 및 차량 (FOS maltodextrin)의 수량 솔루션의 포화 상태를 결정 합니다. 큰 볼륨 증가 위험 포부의 경험에서 더 이상 30 µ L (kg 당 ~ 20 mL) 액체의 돌 2에 마우스 시행 수 있습니다. 살 균 5% 포도 당 염 분의 180 µ L을 포함 하는 각 관으로 직렬 희석 6 1.5 mL microcentrifuge 튜브 준비. 무게는 probiotic prebiotic 혼합물의 약 0.2 g 수 살 균 방식으로 5% 포도 당 식 염 수의 1 mL에서 녹 이십시오. 한 30 초 피펫으로 덩어리를 소용돌이. 볼 수 없는 수 풀은 관찰 될 때까지 반복 합니다.참고: Maltodextrin 솔루션 점성 만들고 솔루션 채도에 기여 합니다. 직렬 희석 단계 1.1에서에서 준비 하는 튜브를 사용 하 여 수행 합니다. 소용돌이를 섞어입니다. 부인 한 천 판의 이라는 사분면에 모든 희석의 40 µ L 플레이트. 중복에서 각 희석 접시 아래 혐 기성 품 어 (또는 microaerophilic) 37 ° C에서 가스 팩을 사용 하 여 진공 항아리에 48 h에 대 한 조건. 사분면 당 20-70 식민지의 범위 내에서 각 접시를 계산 합니다. 평균 접시 같은 희석으로 계산 하 고 원하는 단위를 다시 계산할. 2. gavage probiotics 및 prebiotics의 준비 참고: 적절 한 해체 probiotic의 고 prebiotic gavage 동안 먹이 바늘을 통해 액체의 원활한 주입을 보장 하기 위하여 필요한 이다. Prebiotics 그리고 차량 살 균 microcentrifuge 튜브에 원하는 양의 동결 건조 된 probiotic 생물체의 필요한 금액을 결합 합니다. Probiotic prebiotic 혼합물을 분해 하는 용 매 (5% 포도 당 염 분)의 적절 한 금액을 추가 합니다.참고: 해산의 용량 제한은 prebiotic와 사용 하는 차량입니다. 경험에서 포와 (maltodextrin)와 synbiotic 조합 1 mL의 용 매를 사용 하 여 2 mL microcentrifuge 튜브에 해산 하는 동안 약 0.3 g/mL에서 채도 도달 했습니다. 모든 고체 해산 때까지 혼합 소용돌이입니다. 아래로 pipetting으로 용 매에 고체 입자의 소 헤어를 피펫으로 사용 합니다. 20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 솔루션을 품 어.참고: probiotic prebiotic 솔루션 라이브 문화에서 만든 경우이 단계를 생략 될 수 있습니다. 5 시리즈 접시 gavage는 probiotic을 정확 하 게 계량 하기 전에 부인 한 접시에 10 희석이 강아지를 관리. 정확한 CFU 수 필요 하지 않은 경우이 단계를 생략 수 있습니다. 3입니다. biosafety 캐비닛의 준비 무 균 기술을 유지 하는 biosafety 내각 probiotics를 작업할 때 사용 합니다. 댐 및 난방 담요 (약 38 ℃로 설정)에 강아지 케이지 하나에 설정 담요의 절반. 난방 담요의 나머지 절반에 깨끗 하 고 빈 동물 케이지를 놓습니다. 소독 또는 멸 균, 흡수 성 패드 gavage 동안 마우스 경향이 난방 담요에 장소. 기존, 댐 만든 둥지 위에서 새끼에 대 한 중첩 자료를 수집 하 고 장갑 낀된 손, 70% 에탄올을 사용 하 여 소독 하 고 건조를 사용 하 여 새로운 원뿔 중첩 컵을 만들. 깨끗 하 고 빈 들고 장에이 새로운 둥지를 배치 합니다. 이 gloved 손 둥지의 향기의 전송을 용이 하 게 하 고 따라서 cannibalization의 위험 감소 절차에 대 한 그들을 처리 하는 동안 강아지에 다른 향기의 도입을 최소화 합니다. 케이지를 들고 원뿔 둥지에 새끼를 이동 하 고 캐비닛에서 댐 케이지를 제거 합니다. 이 절차 동안 새끼를 청문회에서 그것을 방지 하 여 댐에 대 한 스트레스를 줄인다.참고:는 probiotic murine 내장의 알려진된 식민지 개척자 인 경우 치료 조건 구분 되어야 합니다 감 금 소 또는 심지어 다른 biosafety 캐비닛을 교차 하는 식민지의 가능성을 피하기 위해. 4. 내 식도 gavage 신생아 마우스의 쉬운 접근을 위한 주사기 포장을 엽니다. 살 균 방식으로 바늘의 포장을 열고 주사기의 머리에 그것을 연결 합니다. 70% 에탄올과 절차 전에 압력솥 바늘을 씻어. 치료 및 제어 그룹에 대 한 바늘의 다른 세트를 사용 하 여 오염을 방지. 주사기에 probiotic 염료 솔루션의 원하는 금액 보다 좀 더 그립니다. 잡고 위로 향하도록 주사기. 그런 다음 풀 다운 추가 하 고 거품을 꺼내 려 하 고 원하는 볼륨에 도달할 때까지 거품과 여분의 액체 볼륨을 추방 하는 플런저에 밀어 손가락으로 끄 적. 그러면 바늘에 공기 공간이 있다. 돌 2 마우스, gavage의 볼륨 30 µ L 넘지 합니다. 살 균 흡수 성 패드가 열 패드 상단에 강아지를 두십시오. 사용 하 여 먹이 바늘 (24 게이지, 1″바늘 길이, 1.25 m m 볼 지름) 외부에서 바로 칼 프로세스 (흉 골의 아래쪽 끝) 아래 바늘의 공을 배치 하 여 식도의 길이 측정. (그림 1) 바늘의 삽입의 제한 주의 주 둥이의 수준에서 바늘을 표시 합니다. 정기적인 호흡 및 피부 핑크 채색을 포함 하는 건강 신호에 대 한 강아지를 관찰 합니다. 디 핑 용 매 (5% 포도 당 식 염 수 또는-매체는 probiotic을 분해 하는 데 사용 하 고 미리 biotic)에서 바늘의 팁을 찍어 먹이 바늘의 외부 표면에 기름칠을. 이 마우스의 식도에 바늘의 부드러운 항목을 지원합니다. 강아지 아저씨 또는 부드럽게 잡고 엄지와 검지 손가락 사이 몸과 머리를 들어 올립니다. 머리, 목 고 몸 직선 위치에서 개최 됩니다. 보유 하지 않습니다 강아지에 대 한 아저씨에 의해 60 이상 거기 s는 질 식으로 이어지는 기도의 방해의 위험. 강아지 쉴 수 있는지 확인 합니다. Scruffing 너무 하드의 징후는 호흡 하는 무 능력, 중대 한 헐 떡 거리 고 혀는 입 밖으로 확장을 포함할 수 있습니다. 강아지의 색상 및 전체 절차 동안 호흡을 모니터링 합니다. 그것은 목 구멍의 뒤쪽에 도달할 때까지 몸통의 평면에 45 ° 각도로 강아지의 입의 중앙에 바늘의 전구를 삽입 합니다. 부드럽게 선회 바늘의 전구에 의해 바늘의 각도 변경 하 고 주사기를 이동 때까지 (강아지의 등 쪽 측)으로 gavaging 사람에서 멀리는 강아지의 척추 칼럼의 평면에 평행한. Scruffing 강아지 목 구멍 뒤쪽 자리에 바늘을 유지 하는 데 도움이 또한 몸 놀 림에서 마우스를 방지 한다. 바늘의 공 사전 하거나 각도 변경 하는 동안 목 구멍의 뒤쪽에 대 한 어떤 압력을 발휘 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. 마우스는 바늘을 삼 키 지 하려고, 그것은 자연스럽 게 아래쪽으로 슬라이드 하 고 주 둥이 바늘에 마킹 정렬 때 움직임을 체포 허용. 주사기 및 바늘은 일반적으로 충분히 기한 아래로 슬라이드 무거운 중력. 바늘의 무게에 항상 그래서 바늘은 gavage을 수행 하는 사람에서 더 하향 압력으로 식도 아래로 쉽게 슬라이드를 지원. 바늘 목 구멍 뒤쪽 저항을 충족 하는 경우 바늘과 다시 각도의 공을 꺼내 약간 gavage 바늘 작은, 1 mm 단위로 천천히 (처리기의 오른쪽) 마우스의 왼쪽을 향해 입 안으로 바늘을 철회 한다. 바늘은 쉽게 식도 아래로 슬라이드를 시작 한다. 바늘 바늘에 마킹 입에 도달 하기 전에 중지 하는 경우 솔루션을 주사 하지 마십시오. 20 개 이상에 대 한 삽입 바늘을 유지 하지 않는 s. 이 경우, 주사기 몸통에 평행 하 게 유지 하면서 천천히 바늘을 철회 하 고 30 종이 수건에 나머지 강아지 용 매와 바늘의 외부 표면 윤 활 후 다시 1 분 시도 gavaging s.참고: 마 취 사용 되지 않습니다 절차에 대 한 마우스의 응답 gavage의 성공을 측정 하는 데 필요한 만큼. 때 먹이 바늘에 표시 주 둥이 위에 고 주 둥이 끝에 정렬, 이동 또는 더 이상 어떤 사전 바늘 게 하지 마십시오. 천천히 원하는 양의 액체를 주사. 액체 발음은 코를 통해 거품을 경우 즉시 주입을 중지 하 고 천천히 바늘을 철회. 강아지의 복구에 도움이 열 패드에 종이 타월에 똑바로 놓습니다. 지속적인된 호흡 문제에 대 한 밀접 하 게 모니터링 하거나 포부를 나타내는 강아지의 색상에서을 변경 합니다. 즉시 발음가지고 강아지 안락사 gavage 완료 되 면, 부드럽게 삽입 된 같은 각도로 먹이 바늘을 철회 한다. 따뜻하게 난방 패드에 종이 타월에 강아지를 두십시오. 정상적인 활동 및 호흡 패턴을 회복 하는 강아지에 대 한 대기 10 s. 강아지의 몸에 건강 한 분홍색 색조 표시 그리고 염료만 표시 되어야 위 구획에. 다시 다른 강아지와 새 장으로 이동 합니다.참고: Gavaging 블루 식용 색소는 위에서 설명한 절차를 연습 하는 우수한 방법. gavage 성공 하면 마우스의 위 블루 색상으로 표시 됩니다. 파란색 염료 (목, 가슴이 나 겨드랑이 지역) 강아지의 위장에 밖으로 발견 되 면 동물 해야 될 고통 없이 안락사 (동물 보호 규칙)에 따라이 식도 또는 포부의 파열을 나타냅니다. 5. 식민 분석을 위한 intestional 샘플의 수집 후속 모니터링 또는 gavaging, 동안 새끼에서 지저분한 미생물 샘플을 수집 합니다.참고: 강아지 자주 urinates defecates 때 gavaged 그리고이 이번 미생물 분석을 위한 분 변 샘플을 수집 하는 기회로 사용할 수 있습니다. 실험의 종료에 대 한 내장에서에서 수집 십이지 장 직장에 새끼의 안락사 후. 외과 보드에 강아지를 고정 하 고 70% 에탄올으로 피부를 소독. 70% 에탄올와 250 ° c.에 뜨거운 비드 살 균 소독 도구를 사용 하 여 복 층을 손상 하지 않고 4 개의 사분면으로 피부를 버려야 살 균 도구의 다른 세트를 사용 하 여 4 개의 사분면으로 복을 잘라내어 내장 장기 노출 되는 방식에서 중심에서 이동. 위장을 찾아서 pyloric 괄약근 아래와 직장의 끝을 꼬집어을 클램프를 사용 하 여. 소장을 간소화 하 고 mesenteric 조직과 결합 조직에서 그것을 해방 하는 무딘 도구 또는 집게를 사용 하 여 내장의 길이 실행 합니다. 일단 내장의 전체 길이 결합 조직, 클램핑 된 끝에 컷의 해제 되었습니다. 표시 된 소장 방향 알루미늄 호 일, 안전한 방법으로 포장 및-80 ° c.에 동결참고: DNA 추출 절차는이 시점에서 동결 없이 밖으로 수행할 수 있습니다. 파란색 염료는 24 시간 이상 대 장 통과 보였다 또한 및 컬렉션 샘플의 창 자는 적어도 24 시간 수집 하는 때 식민 분석은 최고의 게시물 마지막 gavage. 뚜렷이 gavage 혼합물을 통과 하는 비-준수 박테리아에 의해 그 timepoint 전에 신호를 증폭 될 수도 있습니다. 6. DNA 추출 식민지 분석 창에서 참고: DNA 추출 이루어집니다 내장 DNA 추출에 대 한 프로토콜 수정 최적화와 상업 키트를 사용 하 여. 난방 장치 원하는 온도를 설정 하 고 솔루션을 변경 또는 미리 온난화 필요 적절 하 게 준비를 확인 합니다. 효소 세포의 용 해 버퍼 (ELB)를 다음과 같이 준비: 20 mM Tris Cl, 2mm 나트륨 EDTA와 1.2% 솔루션 트라이 톤 X-100. PH 8.0에 조정 합니다. ELB를 사용 하기 전에 즉시 lysozyme 20 mg/mL의 최종 농도에 추가 합니다. 미리 제거 모자 분석 균형에 가닛 비드 튜브 무게.참고:이 이루어집니다 있도록 필요한 무게 지나쳐 갔다 면 쉽게 장 내용을 제거 하. 멸 균 일회용 메스를 사용 하 여 작은 세그먼트로 창 고 미리 무게 가닛 비드 튜브로 원하는 세그먼트를 특 종.참고: 각 샘플 사이의 scalpels DNA 유비 쿼터 스 하 고 PCR 결과 영향을 미칠 수 변경 해야 합니다. 각 관 (에서 단계 6.1) lysozyme와 ELB의 1 mL를 추가 vortexing 구슬 때리는에 놓고 5 분 동안 최대 설정 (14)에서 실행 합니다. 일단 조직 중단 37 ° C 물 목욕 튜브를 전송 하 고 30 분 동안 품 어.참고:이 단계 lysozyme 활성화 하 고 그람 양성 세균의 세포 벽 peptidoglycan의 붕괴를 유도 하기 위해 수행 됩니다. ML 당 600 mAU의 농도에서 모든 샘플에 대 한 가수분해 K의 20 µ L 튜브를 준비 합니다. 10 분 동안 400 x g 에서 튜브를 원심. lysate 구슬 위에 일부 조직 잔류물 명확 보일 것입니다. 가수분해 K를 포함 하는 관으로 상쾌한 (상위 단계)의 180 µ L를 전송 하 고 튜브를 알 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다. 15 대 한 소용돌이를 섞어 s. 10 분 동안 56 ° C에서 난방 블록에 튜브를 놓습니다. 튜브를 100% 에탄올의 200 µ L를 추가 하 고 혼합 15 vortexing s. (Kit)에서 스핀 열 lysate의 약 600 µ L를 추가 합니다. 8000 x g에서 1 분간 원심 분리기. 통해 삭제 합니다. 6.12 단계를 반복 하 여 모든 lysate 그려 왔다 열을 통해. 새로운 컬렉션 튜브에 열을 배치 합니다. 1 분 동안 8000 x g 에서 AW1 버퍼 및 원심 분리기의 500 µ L를 추가 합니다. 삭제를 통해 흐름. 8000 x g 3 분 동안에 500 µ L AW2 버퍼와 원심 분리기를 추가 합니다. 통해 흐름을 무시 하 고 원심 8000 x g 3 분에 빈 컬렉션 튜브에 열. DNA 차입 튜브에 열을 전송. 막에 직접 PCR 학년 초순의 60 µ L을 추가 하 고 실 온에서 2 분 동안 품 어. 37 ° C에 미리 데워 차입 물을 사용 하 여 elute. 차입 절반 최종 차입 볼륨을 사용 하 여 두 번 수행할 수 있습니다 그리고 6.15 수확량 증가를 두 번 단계 반복. 8000 x g elute DNA에서 1 분간 원심 분리기. 원하는 정량화 방법을 사용 하 여 eluted DNA의 농도 측정 합니다. 추출 공정 수율 10-40 ng / µ L DNA의 범위에 있습니다. -20 ° c.에 eluted DNA 저장 7. 정량 설정 PCR 조건 컴퓨터를 켜고 실시간 정량 Pcr 기계에 표 1 에 프로그램을 로드. 40 주기 위한 표 1 에 3 ~ 5 단계를 반복 하 고 반응의 끝에 4 ° C에서 샘플을 잡고. PCR 실험 설치 사용 하 여 뇌관 및 온도 표 2에서 발견. 사용 하 여 농도 및 반응 조건 표 3에서 발견. 절차 상의 변화에 대 한 제어를 3 중에 각 반응을 설정 합니다. 정량 시스템 및 프로그램 단계의 7.1 시스템에 로드 하는 실행에 PCR 반응 튜브/접시를 놓습니다. 실행의 끝에 튜브 제거, 4 ° C에 그것을 배치 하 고 젤 로드에 대 한 준비. 8입니다. LP 식민의 정량화 10 µ L 또는 표3 20 µ L 반응에 대 한 정량 믹스를 준비 합니다. LP genomic DNA 표준 곡선 107 101 복사본 / µ L를참고: 각 희석의 4 µ L 도금 될 것입니다, 이후 4 µ L에 107 복사본 또는 2.5 µ L 당 106 부 x 필요 시작 재고 합니다. 동일한 원리를 사용 하 여 커브의 나머지 부분에 대 한. 1:4 희석 준비: 50 µ L µ L 당 107 부.LPDNA + dH2O의 46.85 µ L의 3.147 µ L = 2.5 µ L 당 106 복사본 x 직렬로 10 배 희석: 5 µ L 45 µ L dH2O 105 복사본 / µ L x 1.25에 대 한 추가. 잘 당 희석 당 4 µ L 플레이트. LP amplicons의 시각화 2 %agarose 젤을 사용 하 여 명확한 분리를 도달 하는 ~ 197 bp lp로 증폭된 한 파편. 젤에 PCR 제품 각의 9 µ L을 로드 합니다. 120 V에서 30 분간 젤을 실행 합니다.