人类多能干细胞有效分化为肝细胞
Summary
该协议详细介绍了单层无血清方法,在18天内从人类多能干细胞(hPSCs)中高效生成肝细胞样细胞。这需要六个步骤,因为hPSCs在形成肝细胞样细胞之前,按顺序分化成中间细胞类型,如原始条纹、最终内皮、后前体和肝芽祖细胞。
Abstract
肝脏排毒有害物质,分泌重要蛋白质,并执行关键的代谢活动,从而维持生命。因此,肝衰竭(可能由慢性酒精摄入、肝炎、急性中毒或其他侮辱引起)是一种严重疾病,可最终导致出血、黄热病、昏迷,并最终死亡。然而,治疗肝功能的方法,以及肝功能和疾病的研究,由于人类肝细胞的缺乏,部分受阻。为此,该协议详细介绍了人类多能干细胞(hPSCs)与肝细胞样细胞的有效分化,其指导是一个发展路线图,描述了肝脏命运是如何在六个连续分化步骤中指定的。通过操纵发育信号通路,促进肝脏分化,并明确抑制不需要的细胞命运的形成,这种方法在第6天有效地生成人类肝芽祖细胞和肝细胞样细胞的种群和 PSC 差异的 18 个。这是通过时间精确控制发展信号通路实现的,由无血清培养基中的小分子和生长因子施加。该系统的分化发生在单层,并产生肝细胞样细胞,表达特征肝细胞酶,并有能力移植慢性肝衰竭的小鼠模型。在体外有效生成大量人类肝细胞的能力对治疗肝衰竭、药物筛选和肝病的机械研究都有影响。
Introduction
该协议的目的是有效地区分人类多能干细胞(hPSCs)到丰富的肝脏芽祖细胞和肝细胞样细胞2。获得现成的人类肝脏祖和肝细胞样细胞将加速研究肝功能和疾病的努力,并可能支持新的细胞移植疗法肝衰竭3,4 5.这在过去被证明是具有挑战性的,因为hPSCs(包括胚胎和诱导多能干细胞)可以分化成人体的所有细胞类型;因此,很难将它们完全区分为单细胞类型的纯种群,如肝细胞6。
要将hPSC精确区分为肝细胞,首先不仅要了解肝细胞是如何指定的,还要了解非肝细胞类型是如何发育的。了解非肝细胞如何发育对于在分化期间从逻辑上抑制非肝系的形成非常重要,从而专门指导hPSC走向肝脏命运2。其次,必须划定hPSC区分肝脏命运的多重发育步骤。众所周知,hPSCs在形成肝细胞样细胞(HEP)之前,会按顺序分化成多种细胞类型,称为原始条纹(APS)、最终内皮(DE)、后前体(PFG)和肝芽祖细胞(LB)。早期的工作揭示了指示肝脏命运的信号和抑制交替非肝细胞类型(包括胃、胰腺和肠道祖细胞)形成的信号,每个发育系选择2,7,8.
总体而言,这些见解已经产生了一种无血清,单层方法,以区分hPSCs对原始条纹,明确的内皮,后前体,肝芽祖,最后,肝细胞样细胞2。总体而言,该方法涉及以适当的密度在单层中播种 hPSC,制备六种分化介质的鸡尾酒(包含调节各种发育信号通路的生长因子和小分子),以及依次添加这些介质,在18天内诱导分化。在此过程中,不需要细胞的传递。值得注意的是,由于这种方法明确包括抑制非肝细胞类型形成的信号,这种分化方法1通过与现存的肝细胞和肝细胞样细胞的比较,更有效地生成肝祖和肝细胞样细胞区分方法2,9,10,11,12 。此外,本文中描述的协议使肝细胞的生成更快,最终表达出比其他协议9、10产生的肝转录因子和酶的更高水平,11,12.
与当前差别化协议不同,此处描述的协议具有某些优势。首先,它需要hPSC的单层分化,这在技术上比三维分化方法要简单,例如那些依赖于胚胎体的方法13。其次,这种方法利用了最近的进步,即最终内皮细胞(肝细胞的早期前体)可以在hPSC分化2,7的2天内有效和迅速生成,从而使后续生产纯度提高的肝细胞。第三,在并排比较中,该方法2产生的肝细胞样细胞产生更多的ALBUMIN,表达出比其它方法产生的肝细胞更高水平的肝转录因子和酶。 11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
这种方法使丰富的肝芽祖细胞,以及随后的肝细胞样细胞,从hPSC生成。产生丰富人类肝细胞种群的能力对于实际利用这种细胞非常重要。以前从hPSCs生成肝细胞的方法产生了含有肝脏和非肝细胞的不纯细胞群,在移植到啮齿动物体内后,除了肝组织15外,还产生了骨骼和软骨。因此,明确抑制非肝分化对于产生可能适合各种应用的丰富肝脏种群至关重要。
值得注意的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Bing Lim 的讨论,以及斯坦福干细胞生物学和再生医学研究所的基础设施支持。这项工作得到了加州再生医学研究所(DISC2-10679)和斯坦福大学-伯克利西贝尔干细胞研究所(L.T.A.和K.M.L.)和斯坦福贝克曼分子和基因医学中心以及匿名组织的支持。巴克斯特和迪杰诺娃家族(到K.M.L.)。
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
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