Summary

A القائم علي اللوحة فحص الخلايا الخلوية لتقييم الفئران المشيمة الطبيعية خليه القاتل Cytolytic وظيفة

Published: June 02, 2019
doi:

Summary

هنا ، ونحن نقدم منهجيه مفصله لعزل وتقييم وظيفة السامة للخلايا من الخلايا القاتلة الطبيعية من مشيمة عن طريق فحص لوحه الملونة. تم اختيار نموذج الفئران الضغط ترويه المنخفضة من الاسكيميه المشيمة لإثبات العزلة بوساطة الأجسام المضادة وتقييم الوظيفة السامة للخلايا من الخلايا القاتلة الطبيعية.

Abstract

ومن المعروف جيدا ان خلايا القاتل الطبيعي الساقطيه (NK) تلعب دورا حاسما في إنشاء والحفاظ علي الحمل العادي. وقد أظهرت الدراسات الحديثة السكان المتغيرة من الخلايا المتداولة و الساقطيه NK في النساء الذين يعانون من مضاعفات الحمل السلبية مثل الإجهاض المتكرر ومقدمات الارتعاج. وقد أظهرت الدراسات من مجموعتنا ان ارتفاع ضغط الدم في الحمل يرتبط مع زيادة عدد الخلايا المنشطة NK في المشيمة استنادا إلى التعبير عن علامات التنشيط السطحية. توفر هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتقييم الوظيفة السامة للخلايا من خلايا ناغورني كاراباخ المعزولة عن الاسترضاء في نموذج حيواني شبيه بتسمم الحمل من نقص ترويه المشيمة المستحث جراحيا. يتم وصف الخطوات التالية بالتفصيل: توليد تعليق خليه واحده ، وعزل الخلايا NK ، والتحفيز الحيوي السابق ، المستجيب: الخلية المستهدفة الثقافة المشتركة ، وفحص الخلايا الخلوية.

Introduction

تسمم الحمل هو اضطراب ارتفاع ضغط الدم الذي يتسم به تقييد نمو الجنين ، وتلف الأعضاء النهائية ، والتنشيط المناعي المزمن. يؤدي التنشيط المناعي المزمن لدي النساء اللاتي يعانين من الارتعاج إلى زيادة تداول السايتوكينات التهابيه المشيمة ، وعدم التوازن في الخلايا التائية للخلايا ، وزيادة عدد الخلايا النشطة القاتلة الطبيعية (NK)1. وتبين الدراسات التي نشرت مؤخرا من قبل مختبرنا دورا للخلايا ناغورني كاراباخ في التسبب في بعض من الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة بمقدمات الارتعاج في نموذج الفئران الضغط Perfusion الرحمية (RUPP) من الارتعاج. باستخدام التدفق الخلوي لقياس التعبير السطحي لعلامات التنشيط علي خلايا ناغورني كاراباخ ، زاد عدد السكان من خلايا ناغورني كاراباخ المنشطة في الدورة الدموية و مشيمة من الفئران rupp مقارنه مع الفئران الحامل العادي (NP) لوحظ2.

لتاكيد الملاحظات تدفق الخلوية ، أجريت دراسات وظيفية لتقييم النشاط السامة للخلايا من الخلايا NK معزولة من مشيمة من الفئران NP و rupp. هناك العديد من الطرق المتاحة لتقييم وظيفة السامة للخلايا من الخلاياCD8 + T السامة للخلايا والخلايا NK. معيار الذهب للتحليل السام للخلايا وظيفية هو فحص الإفراج عن الكروم3. وتشمل البروتوكولات المتقدمة الأخرى المستخدمة التدفق الخلوي4، الصورة الخلوية5، calcein الإصدار6، والأكثر حداثة التالق7. سيوفر هذا الفيديو بروتوكولا مفصلا بشان استخدام المقايسة الراسخة لنازعه الهيدروجين (LDH) لقياس الوظيفة السامة للخلايا في الخلايا NK باستخدام مجموعه المقايسة الخلوية المتاحة تجاريا LDH.

Protocol

تمت الموافقة علي جميع البروتوكولات من قبل اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية والاستخدام في المركز الطبي لجامعه ميسيسيبي. وكانت الرعاية والمناولة للحيوانات في اتفاق مع المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لعلاج الحيوانية الاخلاقيه. 1. اللمفاوية خليه العزلة من Placentas <li…

Representative Results

تم احتضان خلايا المشيمة NK التي تم الحصول عليها من الفئران NP و rupp ل 5 ح مع الخلايا المستهدفة في اعلام الخاصة بهم بنسبه 50:1 (NK: الهدف). وسجلت الامتصاص عند 490 نانومتر وترد البيانات الاوليه في الجدول 2. وتم حساب الامتصاص المتوسط للخلفية المتوسطة الثقافية والآبار التي تتحكم في تصحيح الحجم. …

Discussion

وهناك عدد من الملاحظات الرئيسية الهامه للنظر في النتائج المثلي. العقم من الخلايا المستخدمة مهم جدا. بعد جمع المشيمة ، من المهم ان يتم اعداد وعزل خلايا ناغورني كاراباخ في ظل ظروف معقمه في خزانه السلامة الاحيائيه. وعلاوة علي ذلك ، لان جميع الخلايا الإفراج عن LDH علي الاضرار الخلوية ، ينبغي توخ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت المنحة R00HL130456 ، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة ببموجب القرار P20GM104357 ، ميسيسيبي INBRE ، الممولة من قبل جائزه التنمية المؤسسية (IDeA) من المعاهد الوطنية للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت منحه رقم P20GM103476. والمضمون هو المسؤولية الوحيدة للمؤلفين ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

1.5 mL Eppendorf tube Fisher 5408129
100 µL Filter Fisher 22363549 Nylon Mesh
15 mL conical tube Fisher 0553859A
3 mL syringe Fisher 14823436
50 mL conical tube Fisher 7203510
6-well cell culture plate Corning 720083
96-well Tissue Culture Plate CELLTREAT 229190 Sterile, Round Bottom
AOPI Nexcelom CS201065ML
Cell scraper Fisher 8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer Nexcelom N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit Promega G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit Invitrogen 11061D
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D
EDTA Sigma Aldrich EDS-100G
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Flow Cytometry Tube Corning 352008
Lymphoprep Fisher NC0460539 Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS Fisher SH3025801 10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Petri dishes Fisher 9720500 Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a BD Biosciences 555006
Purified Mouse anti-Rat CD3 BD Biosciences 554829
Recombinant Rat IL-2 R&D Systems 502-RL
RPMI Gibco 11875135 1640 Medium
T25 flask Corning 430639
Trypsin ThermoFisher 15090046
YAC-1 cell ATCC TIB-160

References

  1. Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
  2. Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
  3. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  4. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  5. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
  6. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  7. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
  8. Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
  9. Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
  10. Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).

Play Video

Cite This Article
Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).

View Video