녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해
Summary
여기, 우리 향상 된 녹색 형광 단백질 표현 대장균을 사용 하 여 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.
Abstract
이 원고 먹어서 분석 결과 수행 하는 간단 하 고 재현할 수 방법을 설명 합니다. 이 방법의 첫 번째 부분 포함 애완 동물-스모-EGFP 벡터 구축 (스모 = 작은 유비퀴틴-같은 한정자) 녹색 형광 단백질 (EGFP) 대장균 (BL21DE)에서 향상 된 표현. EGFP 표현 대장균 은 37 ° C에서 1 시간에 대 한 대 식 세포와 coincubated 부정적인 제어 그룹은 시간의 동일한 금액에 대 한 얼음에 알을 품을. 다음, 대 식 세포는 평가 대 한 준비. 이 기술의 장점 간단 하 고 간단한 절차, 그리고 먹어서 두 흐름 cytometer 및 형광 현미경에 의해 측정 될 수 있다. EGFP 표현 대장균 안정 하 고 대 식 세포는 paraformaldehyde로 고정 한 후에 강한 형광 신호를 표시 합니다. 이 방법은 뿐만 아니라 대 식 세포 세포 선 또는 기본 세포 생체 외에서의 평가 적합 하지만 granulocyte 및 monocyte 주변 혈액 단 세포에서 식 균 작용의 평가 위해 또한 적당 한. 결과 보여 젊은 (8 주 된) 쥐에서 복 막 대 식 세포의 phagocytic 기능 세 (16 개월) 쥐에서 대 식 세포의 그것 보다 높다. 요약 하자면,이 방법은 대 식 세포 식 균 작용 고 타고 난 면역 계통 기능 공부를 위해 적당 한 이다.
Introduction
대 식 세포 식 균 작용 분석 자주 타고 난 면역 기능을 공부 하는 데 사용 됩니다. 타고 난 면역 반응 감염 민감성을 나타낼 수 있습니다. 대 식 세포 세포 라인 면역학 연구에 널리 사용 됩니다. 그러나, 확장된 통로 유전자 손실이 발생할 수 있습니다 및 이러한 셀 라인에서 면역 기능을 손상. 따라서, 기본 복 막 대 식 세포는 세포 기능1을 공부 하는 이상적인 개체.
타고 난 면역 반응 세 본문에 그대로 생각 했다, 비록 phagocytic 능력 그는 더 젊은에2,3바디 비해 줄어들 수 있습니다. 여기, 우리가 영 (8 주-오래 된)와 세 (16 개월) 마우스 EGFP 표현 대장균은, 빠르고, 편리 하 고 경제적으로 실현 가능한를 사용 하 여 복 막 대 식 세포의 식 균 작용을 평가 하는 방법을 보여줄 것입니다.
이러한 박테리아는 안정 되 고 대 식 세포는 4% (w/v) paraformaldehyde로 고정 한 후에 강한 형광 신호를 표시 하기 때문에 EGFP 표현 E. 콜라이 긴장의 사용이 분석이 결과의 장점 중 하나입니다. 또한, 대장균의 EGFP 표현 사용 하 여 연구원은 필요 하지 않습니다 더 먹어서, 시간 후 얼룩. 또한, 대 식 세포는 대장균 EGFP 표현 버섯 또는 구슬 fluorescein 표시를 사용 하 여 보다 더 먹어서 분석 결과 대 한 적당 한 만드는 대장균 표면 항 원에 대 한 immunoresponsive.
EGFP 표현 대장균, 함께 먹어서 분석 결과 쉽게 2 시간에서 달성 고 두 흐름 cytometry 및 형광 현미경 검사 법, 연구자의 목적에 따라 측정. 때문에이 메서드는 직접 phagocytic 능력을 측정, 결과 다른 간접적인 방법 보다 더 재현.
이 방법은 또한 RAW264.7 세포 라인에서 검증 된 그리고 인간 주변 혈액 단 세포4. 텍스트 아래이 분석 결과 수행 하기 위한 자세한 단계별 지침을 제공 하 고 연구원은 그들의 실험의 요구에 맞게 수정할 수 있습니다 중요 한 단계를 강조.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 단계는 매우 간단 하 고 간단 합니다. 중요 한 단계 중 하나는 대장균에 EGFP 식을 유도 하는 것입니다. 일반적으로, EGFP, 같은 진핵생물에서 유전자를 대장균같은 원핵생물에서 표현 하 계획 하는 경우는 단백질의 기본 구조 및 활동 변경 단백질 비활성 집계 (포함 시체)를 형성할 것 이다 위험이 있다. 애완 동물-스모 벡터를 사용 하 여 애완 동물-스모-EGFP 플라스 미드…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
국립 자연 과학 재단의 중국 (no. 31800046)는 자연 과학 재단의 요 녕 성 (no. 20170540262)이이 작업 지원. 이 작품은 두 번째 병원의 대련 의료 대학에서 과학 연구 센터의 실험실에서 달성 되었다. 저자는 cytometry, 그녀의 지원에 대 한 샤 오 린 상 및 보 숨어와 동-Chuan 양 비디오 생산에 그들의 지원을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
References
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
