Este protocolo describe el proceso general y control de calidad controles necesarios para la preparación de células sanas de mamíferas adultos solo para preparaciones de RNA-Seq de celulares solo basada en gota, alto rendimiento. Secuenciación parámetros, lea alineación y análisis Bioinformático unicelular aguas abajo también se proporcionan.
El análisis de la expresión génica de células individuales a través de miles de células individuales dentro de un tejido o microambiente es una herramienta valiosa para identificar composición celular, discriminación de Estados funcionales y vías moleculares subyacentes tejido observado funciones y comportamiento de los animales. Sin embargo, el aislamiento de células intactas, sanas de tejidos mamíferos adultos para análisis molecular de la célula descendente posterior puede ser difícil. Este protocolo describe el proceso general y control de calidad verifica necesarios para obtener preparaciones celulares solo adultos de alta calidad desde el sistema nervioso o la piel activa análisis y secuenciación posterior imparcial unicelular RNA. También se ofrecen pautas para el análisis Bioinformático aguas abajo.
Con el desarrollo del alto rendimiento unicelular tecnología1,2 y los avances en Bioinformática fácil de usar herramientas en la última década3, ha surgido un nuevo campo de análisis de expresión génica de alta resolución – secuencia de RNA unicelular (scRNA-Seq). El estudio de la expresión génica de células solo primero fue desarrollado para identificar heterogeneidad en las poblaciones de celda definida, como en las células madre o células cancerosas, o para identificar raras poblaciones de células4,5, que eran inalcanzables utilizando técnicas de secuenciación de RNA a granel tradicionales. Herramientas bioinformáticas han permitido la identificación de subpoblaciones novela (Seurat)2, visualización del orden de las células a lo largo de un psuedotime espacio (monóculo)6, definición de redes de señalización activadas dentro o entre poblaciones ( SCENIC)7, predicción de la Asamblea de solo las células en un espacio 3D artificial (Seurat y más)8. Con estos análisis nuevos y emocionantes para la comunidad científica, scRNA-Seq es rápido-convertirse en el nuevo enfoque estándar para análisis de expresión génica.
A pesar del gran potencial de scRNA-Seq, los conjuntos de habilidades técnicas necesarios para producir un conjunto de datos limpia y a interpretar con precisión los resultados pueden ser difícil para los recién llegados. Aquí, un protocolo básico, pero completo, a partir del aislamiento de las células de tejidos toda primarias a la visualización y presentación de datos para la publicación se presenta (figura 1). En primer lugar, el aislamiento de las células sanas se puede considerar un reto, como distintos tejidos varían en su grado de sensibilidad a la digestión enzimática y posterior disociación mecánica. Este protocolo proporciona una guía en estos pasos de aislamiento e identifica puntos importantes de control de calidad durante todo el proceso. En segundo lugar, puede ser confuso entender la compatibilidad y requerimientos entre la tecnología de la célula y secuenciación de próxima generación. Este protocolo proporciona las directrices para implantar una plataforma fácil de usar, basado en la gotita sola celda el código de barras y realizar la secuencia. Finalmente, la programación es un prerrequisito importante para el análisis de conjuntos de datos transcriptómicos unicelular. Este protocolo proporciona los recursos para empezar con el lenguaje de programación R y proporciona orientación sobre la aplicación de dos populares paquetes de R scRNA-Seq-específicos. Juntos, este protocolo puede guiar a los recién llegados en la realización de análisis scRNA-Seq para la obtención de resultados claramente interpretables. Este protocolo se puede ajustar a la mayoría de los tejidos en el ratón y lo importante es que podría modificarse para su uso con otros organismos, incluyendo el tejido humano. Se requerirá de ajustes según el tejido y el usuario.
Hay varias consideraciones a tener en cuenta siguiendo este protocolo; incluyendo 1) siguiendo todas las pautas de control de calidad en los pasos 1 y 2 del presente Protocolo se recomienda para asegurar una suspensión unicelular viable de todas las células dentro de la muestra de interés asegurando precisión total número recuento (resumido en figura 2 ). Una vez que esto se consigue, y si se siguen todas las condiciones optimizadas, las medidas de control de calidad pueden ser bajadas (para ahorrar tiempo – preservando calidad de RNA y la reducción de la célula pérdida). Confirmando el aislamiento exitoso de células alta viabilidad de los tejidos de interés es muy aguas abajo se recomienda antes de cualquier proceso. 2) ya que algunos tipos de células son más sensibles que otras al estrés, técnicas de disociación excesivas inadvertidamente pueden sesgar a la población, por lo tanto confundir análisis aguas abajo. Disociación suave sin corte celulares innecesarios y la digestión es fundamental para el logro de altos rendimientos celulares y una representación exacta de la composición tisular. Las fuerzas de corte se producen durante las etapas de trituración, FACS y resuspensión. 3) como con cualquier trabajo del RNA, es mejor introducir como poco Rnasa adicional en la muestra como sea posible durante la preparación. Esto le ayudará a mantener la alta calidad RNA. Utilice soluciones de inhibidor de la ribonucleasa con enjuague para limpiarlos herramientas y cualquier equipo que no es libre de Rnasa, pero evitar los productos tratada con DEPC. 4) realizar los preparativos lo antes posible. Esto ayudará a mantener la alta calidad RNA y reducir la muerte celular. Dependiendo de la longitud de la disección del tejido y el número de animales, tener en cuenta a partir de preparaciones de disecciones múltiples al mismo tiempo. 5) preparar las células en hielo cuando sea posible para mantener la alta calidad RNA, reducir la muerte celular y el retraso de la célula actividad transcripcional y señalización. Aunque helada es ideal para la mayoría de los tipos de la célula, algunos tipos de células (e.g., neutrófilos) se desempeñan mejor cuando se procesa a temperatura ambiente. 6) Evite productos de tratada con DEPC, EDTA, magnesio y calcio durante la preparación de la célula.
Este protocolo demuestra cómo la preparación adecuada de las células puede revelar la heterogeneidad transcripcional de miles de células individuales y discriminar Estados funcionales o identidades únicas celulares dentro de un tejido. El Protocolo no requiere proteínas reportero fluorescente o herramientas de transgénicos y se puede aplicar al aislamiento de las células de diversos tejidos, incluyendo los de seres humanos; teniendo en cuenta cada tejido es único y este protocolo requiere cierto grado de ajuste o la modificación.
Los programas transcripcionales diversos y dinámicos dentro de las células han hecho hincapié en el valor de la sola célula genómica. Además de aislar el RNA de alta calidad, un paso de preparación de muestra crítica necesario para conjuntos de datos de alta calidad es asegurar que las células se liberan completamente de tejido y que las células son sanos e intactos. Esto es relativamente directo para la recolección de células que son fácilmente liberados, como la circulación de las células o en los tejidos donde las células se mantienen libremente, como en los tejidos linfoides. Pero esto puede ser un reto para otros tejidos adultos, debido a la arquitectura celular altamente desarrolladas que abarcan largas distancias, que rodea la matriz extracelular y las proteínas citoesqueléticas rígido a menudo involucrados en mantener la estructura de la célula. Incluso con técnicas de disociación apropiado para la versión completa de las células, es posible que la rigurosa y a menudo largas elaboraciones alteraría integridad calidad y celular mRNA. Además, las altas temperaturas usadas para ayuda de enzima disociación también afectan a firmas transcripcional29,30. El propósito del protocolo es presentar control de calidad verifica, utilizando tejidos como el nervio myelinated adulto y la piel de adultos de ricos en matriz extracelular, para demostrar cómo la optimización puede ayudar a superar estos obstáculos.
Una consideración importante al diseñar cualquier experimento de scRNA-Seq es la elección de la profundidad de la secuencia. La secuencia puede ser altamente multiplexada y leer profundidad puede variar de ser muy bajo con Seq gota2 a hasta 5 millones de lecturas/celular14 utilizando un método integral de RNA-Seq como Smart-SS. Mayoría de los experimentos scRNA-Seq puede detectar transcripciones de moderada a alta expresión con secuencias tan bajo como 10.000 lecturas/célula, que es generalmente suficiente para celular tipo clasificación41,42. Profundidad de la secuencia superficial es de valor para ahorrar en costos de secuenciación para detectar poblaciones de raros de la célula a través de tejidos complejos que pueden ser necesarios miles de células atribuir con confianza las poblaciones raras. Pero la secuencia de la profundidad no es adecuada cuando es necesaria obtener información detallada sobre expresión de genes y procesos asociados con firmas transcripcionales sutiles. Actualmente, se estima que la gran mayoría de los genes en una célula se detecta con 500.000 lecturas/cell, pero esto puede variar dependiendo del protocolo y tejido tipo43,44. Mientras que secuencia de transcripción larga duración evita la necesidad de Asamblea y, por lo tanto, detectar novela o variantes raras de empalme, los costes de la secuenciación a menudo limitan escala estos enfoques para examinar miles de células que comprende un sistema complejo tejido. En contraste, 3′ etiquetado bibliotecas unicelular como las descriptas en este protocolo por lo general tienen menor complejidad y requieren menor secuencia. Es importante tener en cuenta que pueden ser secuenciadas de bibliotecas mediante el protocolo descrito en uno de los secuenciadores compatibles cinco: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 ejecutar rápida y alto rendimiento, 4) NextSeq 500/550 y 5) MiSeq.
Un enfoque alternativo a celular solo RNA-Seq, que reduce la necesidad de delicados tejidos y células manejo todavía mantiene algunos de los beneficios de célula única RNA-Seq, es el análisis de ARN de núcleos solo45. Este enfoque permite la tramitación más rápida reducción de la degradación del RNA y medidas más extremas para asegurar la adecuada liberación de núcleos y así probablemente permite una captura de más confianza de los perfiles transcripcionales que representa todas las celdas dentro de un determinado tejido. Esto, por supuesto, sólo daría una parte de la actividad transcripcional presente dentro de una célula dada, así dependiendo de lo que son objetivos experimentales de interés este enfoque puede o puede no ser apropiado.
Además de la caracterización completa de identidades celulares en un tejido dado, uno de los más valiosos análisis para conjuntos de datos scRNA-Seq es la evaluación de Estados transcripcionales intermedias en poblaciones celulares ‘definido’. Estos estados intermedios pueden impartir conocimientos sobre las relaciones de linaje entre las células dentro de las poblaciones identificadas, que no era posible con a granel tradicional que acerca de RNA-Seq. Han desarrollado ahora varias herramientas bioinformáticas de scRNA-Seq para aclarar esto. Tales herramientas pueden evaluar los procesos involucrados, por ejemplo, las células cancerosas la transición a un estado oncogénico, metastásico, las células madre maduran en diversos destinos terminal o las células inmunes, transporte entre los Estados activados y quietos. Transcriptoma sutiles diferencias en las células también pueden ser indicativas de sesgos de linaje que, herramientas bioinformáticas desarrolladas recientemente como FateID, puede inferir47. Puesto que las diferencias entre las células de transición pueden ser difíciles determinar dadas las diferencias transcripcionales puede ser sutil, la secuencia más profunda puede ser necesario46. Afortunadamente, la cobertura de una biblioteca bajo secuenciada puede aumentar si está interesado en sondear el conjunto de datos más de nuevo ejecutando la biblioteca en otro célula de flujo.
Tomados en conjunto, este protocolo proporciona un flujo de trabajo fácil adaptación que permite a los usuarios de perfil transcripcionalmente cientos o miles de células individuales dentro de un experimento. La calidad final de un conjunto de datos de scRNA-Seq se basa en el aislamiento optimizada de la célula, citometría de flujo, generación de biblioteca de cDNA e interpretación de matrices de crudo gene-código de barras. Para ello, este protocolo proporciona una descripción comprensiva de todos los pasos claves que puede ser fácilmente modificado para permitir estudios de tipos de tejidos diversos.
The authors have nothing to disclose.
Reconocemos que el personal de apoyo en la instalación de servicios de UCDNA, así como el personal de la institución de cuidado Animal de la Universidad de Calgary. Agradecemos a Matt Workentine por su apoyo de Bioinformática y Jens Durruthy por su apoyo técnico. Este trabajo fue financiado por una donación CIHR (R.M. y J.B.), un premio de investigador nuevo de CIHR y J.B., salud investigación Instituto beca (J.S. un infantil de Alberta).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |