Detta protokoll ger en effektiv metod för att mäta LDL kolesterol upptag med realtid tillströmning priser med hjälp av en levande cell imaging system i olika celltyper. Denna teknik ger en plattform för att skärmen den farmakologiska aktiviteten av föreningar som påverkar LDL tillströmning medan övervakning för cellmorfologi och därmed potentiella cytotoxicitet.
Regleringen av LDL kolesterol upptag via Receptorn-medierad endocytos är ett viktigt område av studie i olika stora sjukdomar inklusive metabolisk sjukdom, hjärt- och njursjukdom. För närvarande finns det ingen tillgänglig metod att bedöma LDL-upptag medan samtidigt övervakas för hälsa av cellerna. Den aktuella studien presenterar ett protokoll, med en levande cell imaging analyssystem, för att förvärva seriella mätningar av LDL tillströmningen med samtidiga övervakning för cell hälsa. Denna nya teknik testas i tre mänskliga cellinjer (nedsatt, renal tubulär epitelial och koronar artär endotelceller) under en fyra timmars tid. Dessutom är känsligheten hos denna teknik validerad med välkända LDL-hämmare, Dynasore och rekombinant PCSK9 protein, liksom en LDL upptag promotorn, Simvastatin. Sammantaget ger denna metod en medium till hög genomströmning plattform för samtidigt screening farmakologisk aktivitet samt övervakning av cellmorfologi, därav cytotoxiciteten hos föreningar reglera LDL tillströmning. Analysen kan användas med olika bildsystem och analytiska programvara.
Den Low Density Lipoprotein Receptor Receptorn-medierad LDL endocytos är ett viktigt område för studien eftersom cirkulerande LDL-kolesterolnivåerna är kärnan i hjärt-kärlsjukdom1, njur sjukdom2 samt en mängd inflammatoriska sjukdomar3 och genetiska sjukdomar med mutationer i kolesterol transport gener4,5,6,7. Studier i Receptorn-medierad kolesterol tillströmningen har ledde till identifiering av flera forskningsverktyg, såsom Dynamin-hämmare inklusive den kemiska Dynasore8,9,10, samt LDL-reglerande proteiner såsom Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Skriv 9 (PCSK9)11,12.
LDL-Receptorn endocytos vägen börjar med komplexbildare LDL-Receptorn komplex på cellytan in i clathrin-belagda gropar13. Blåsor bildas då av invagination ytan cellmembranet internalisera det LDL-Receptorn komplexet i vakuoler för transport inuti cellen. Som den bildade vesikler mognar in tidigt och sedan sent endosomes, sjunker pH inuti den sena endosome, orsakar disassociation av LDL från dess receptor14. Tidigare berodde metoder för kvantifiering av LDL tillströmning på radioaktivt märkt 125-LDL samtidig inkubering med celler och efterföljande utvinning av radioaktivt märkt proteinet från celler för kvantifiering15. Detta ersattes sedan av användningen av fluorescently märkta LDL proteiner såsom DiI-LDL, och efterföljande immunfärgning eller utvinning av protein för fluorescerande avläsningar med en spektrofotometer eller plattan läsare15,16. Fluorescently märkt har LDL också använts i fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) för analys av internalisering av LDL och cell surface LDL bindande17. Medan dessa metoder möjliggör insamling av data efter behandling, är övervakning livskraften hos cellerna under behandling inte möjligt.
Sura pH-värde i den sena endosome tillåter användning av en pH-aktiverat fluorescerande LDL-sond som pHrodo Red LDL som fluorescerar i efter internalisering18,19. Denna egenskap kan för en fortlöpande tidsförloppet för bedömning av LDL-upptag i levande celler. Därför detta protokoll använder tredjeparts pHrodo röd-LDL fluorescens imaging i en levande cell analys till seriellt mäta LDL upptag med samtidiga övervakning cell hälsa. Resultaten visar tillförlitligheten i denna nya teknik som testats under en fyra timmars tid kurs i tre olika mänskliga cellinjer, mänskliga nedsatt carcinoma (HepG2) celler, humana epitelceller av (HK2) och nedsatt och mänskliga koronara arterial endotelceller (HCAEC ). Dessa cellinjer är kliniskt signifikanta till LDL clearance20,21,22,23,24,25,26,27 , njur sjukdom28,29,30,31, och hjärtsjukdom32,33, respektive. Förutom övervakning LDL inflödet, omfattar detta protokollet behandling med två välkända LDL hämmare, Dynasore hydrat och rekombinant PCSK9 protein samt en statin inducerare av Receptorn uttryck och LDL-upptag, simvastatin. Dynasore och rekombinant PCSK9 varje arbete genom olika vägar att minska LDL-upptag.
Dynasore är en liten molekyl hämmare av Dynamins10 och minskar LDL-upptag genom att blockera clathrin-beroende endocytos av LDL-Receptorn komplex10,34. Rekombinant PCSK9, däremot, är medlem i peptidase S8 familj som binder till Receptorn och hämmar dess återvinning till cellytan efter släppa LDL från internaliseras komplexet genom att blockera konfirmerande ändringar35,36 . Minskad cell Receptorn Ytors leder så småningom till reducerat LDL-upptag av cellen. Statiner, är medan direkt blockera 3-hydroxi-3-methylglutaryl-coenzym (HMG-CoA) reduktas enzym och därmed biosyntesen av kolesterol, också känt att upregulate uttrycket av Receptorn25,38 leder till ökat LDL-upptag. Känsligheten för detta protokoll är validerad genom att identifiera betydande minskningar i LDL tillströmningen i tre kliniskt relevanta mänskliga cellinjer, HK2, HepG2 och HCAECs, genom Dynasore och/eller rekombinant PCSK9, och en markant ökning av LDL-upptag i HepG2 celler av Simvastatin i en fyra timmars tid kurs med övervakning för cell morfologi/hälsa. Sammantaget ger denna metod en medium till hög genomströmning plattform för samtidigt screening farmakologiska aktivitet och cytotoxiciteten hos föreningar reglera LDL-upptag i levande celler.
I det nuvarande protokollet demonstrera vi användningen av levande cell imaging som en ny och mer effektiv metod för att mäta realtid LDL-upptag under en tid i olika mänskliga cellinjer. Mänskliga nedsatt carcinoma (HepG2) celler används ofta i studier som screening för kolesterolsänkande therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Därför valde vi denna celltyp för att testa kapaciteten hos en levande cell bildsystem för LDL tillströmning studier. Våra resultat tyder på att HepG2 celler är förenliga med denna nya teknik och resultatet i en sigmoideum-liknande kurva som visar kontinuerlig LDL-upptag under hela tillströmning analysens tills 4,33 h som sista slutpunkt (figur 2A och figur 3 ).
Kolesterol homeostas spelar en viktig roll i patofysiologin bakom olika nefropatier. Faktiskt, kolesterol ackumulering i nedsatt vävnad är en stor bidragsgivare till nedsatt fibros leder till kronisk njursjukdom och är en större patologi i olika nefropatier28,29,30,31. Därför undersökte vi vår metod i humana renala epitelceller av (HK2) som en populär och pålitlig cellinje som utnyttjas inom njurmedicin. Våra data stöds också genomförbarheten av det levande cellen imaging systemet för att mäta LDL tillströmningen i HK2 celler. Som visas i figur 2B, tog HK2 celler upp LDL kolesterol linjärt under hela studien tillströmning (4 timmar).
På grund av vikten av kolesterol metabolism i utvecklingen och utvecklingen av åderförkalkning32,33,41, den ledande orsaken till hjärt-kärlsjukdomar, vilket i sin tur är den nummer ett dödsorsaken i hela världen 42, syftar vi till att validera vår metod i en åderförkalkning-relevanta celltyp. Vi använde mänskliga koronara Arterial Endothelial celler (HCAECs), eftersom dessa är en av de första celltyper att utsättas för en kolesterol förolämpning i kranskärl lumen av en åderförkalkning patient. Våra data som visas i figur 2C indikerar att LDL tillströmning metoden fungerar också effektivt med HCAECs. Den resulterande grafen är en sigmoideum-liknande kurva liknande till det av HepG2 celler.
För att testa giltigheten och känsligheten hos denna förbättrade LDL tillströmning analys för screening föreningar som påverkar LDL-kolesterol upptag, använde vi tre kontroller, LDL upptag-sänkande medel Dynasore och rPCSK9 och LDL tillströmning aktivator Simvastatin. Här, vi behandlat ovan nämnde cellinjer (HepG2, HK2 och HCAECs) med optimerad koncentrationer av Dynasore eller rPCSK9 innan tillströmningen analysen. Våra resultat visade att alla tre testade cellinjer svarade att behandlingarna med betydande minskningar i LDL tillströmning under en 4-timmars tid (figur 2). Exempelvis på 4,33 h som den slutliga tidpunkten, behandling med Dynasore vid 40 µM signifikant LDL tillströmningen i HepG2 celler, HK2 celler och HCAECs av 53%, 68% och 54%, respektive (p < 0,0001, Figur 2 A-C och Tabell 2A-C). Dessutom rPCSK9 på 10 µg/mL orsakade en markant 55% minskning i LDL tillströmningen i HK2 celler (p < 0,0001, Figur 2 B och tabell 2B). Våra resultat visade dessutom att behandla HepG2 celler med Simvastatin resulterade i en markant ökning LDL-upptag (figur 3), stödja känsligheten hos denna metod att upptäcka betydande förändringar i LDL tillströmningen. Studier av behandling med rPCSK9 i HepG2 och HCAEC celler ingår inte i detta protokoll som rPCSK9 används som en ytterligare kontroll behandling med väl dokumenterade resultat, men är kostsamt att köpa i små mängder. RPCSK9 var därför endast användas för att validera detta protokoll i HK2 celler.
Levande cellen imaging analys, tillsammans med funktionella och snabb mätning av LDL tillströmning, tillåtet för kontinuerlig övervakning av hälsa och morfologi av celler. Denna fördel kan effektivt identifiera potentiella cytotoxicitet tillämpad föreningar, vilket gör denna metod en idealisk teknik för samtidigt övervakning farmakologiska aktivitet och cytotoxicitet. Siffrorna 5-7 illustrera representativa bilder av tre testade cellinjer på den sista slutpunkten (4,33 h) som en visuell referens för effekten av behandlingarna som LDL Nettoinflödet och visar också den friska morfologin av celler efter de testade behandlingar. Vi rekommenderar okulärbesiktning av alla bilder från varje brunn för att försäkra heathy morfologi av celler under hela studien. Till exempel i data inte visas, när bilderna av HepG2 celler behandlas med 80 μM Dynasore inspekterades, vi observerade indikeringar av cell avlossning som kanterna på cellerna föreföll vara lyfta från plattan, vilket tyder på cell avlossning vid högre koncentrationer av Dynasore. Dessutom inducerad höga koncentrationer av simvastatin (3-10 μM) ledde också till förändrad morfologi indikera apoptos som rapporterats för höga doser av statiner45. Detta protokoll användes för att utföra en titrering av Dynasore behandling vid 20-80 μM och Simvastatin på 0,5-10 μM koncentration, varefter cellen bilderna användes för att analysera cellerna hälsa och fastställa potentiella ctotoxicity av behandlingar på olika koncentrationer. Resultaten föreslås användning av 40 μM för Dyansore och 1 μM för simvastatin som optimala koncentrationer.
Slutligen föreslår vi att utföra en cell densiteten titrering studie om en annan cellinje skall provas i denna metod för att identifiera den optimala mobilnummer per brunn för att få konsekventa resultat. Vår cell densiteten optimering studie visade att 10 000 celler per brunn i en 24-well platta leder till konsekvent LDL tillströmning utfallen för HK2 och HCAE celler. Det är viktigt att notera att för denna LDL tillströmning analys använder levande cell imaging system, en enskiktslager av icke-konfluenta celler jämnt fördelade på brunnarna är önskvärt som klumpar av celler kan ge upphov till fel i normaliserade LDL tillströmning slutvärdena. Anledningen till detta är att för normalisering av tillströmningen data, området fas objekt används som ett mått på cell densiteten och denna parameter kan påverkas negativt när cellen klumpar bildas. Vi observerade att HepG2 celler har en tendens att bilda klumpar när seedade vid tätheter högre än 5 000 celler per brunn orsakar inkonsekvent tillströmning resultat; Därför använde vi 5 000 celler per brunn i en 24-well platta som optimal täthet för HepG2 celler.
Kollektivt, ger vår metod en medium till hög genomströmning plattform för screening farmakologiska aktivitet och cytotoxiciteten hos föreningar reglera LDL tillströmning samtidigt. Denna metod kan lätt anpassas för användning med andra fluorescently-märkt ligander som anger den lysosomala facket för att utvärdera ligand upptag i realtid. Medan detta protokoll erbjuder specifikationerna för InCucyte bor imaging och analyssystem, protokollet kan anpassas för alternativa bildgivande system såsom Cellomics.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av följande bidrag till LAS: National Institute of Health (R56HL132209 och 1R01HL140468) och Miami hjärtat Research Institute. KY är en mottagare av amerikanska hjärtat Association pre Fellowship (18PRE33960070). HepG2 celler var vänligen tillhandahållen av Dr Emmanuel Thomas, universitet av Miami-Miller School of Medicine46,47,48.
pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
MEM | Sigma | M0325 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
24 well plate | Falcon | 353226 | |
40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |