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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
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生物学

LDL コレステロールの取り込みアッセイ セルにライブセル イメージングを使用して正常性の監視

Published: November 17, 2018
doi:
10.3791/58564
, , , , ,
1Interdisciplinary Stem Cell Institute,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiology,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Pharmacology,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 4Dr. John T. Macdonald Foundation Department of Human Genetics,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 5John P. Hussman Institute for Human Genomics,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 6Department of Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism and Endocrinology and the Diabetes Research Institute,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 7Vascular Biology Institute,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 8Peggy and Harold Katz Family Drug Discovery Center,University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine

Summary

このプロトコルは、ライブセル イメージング細胞型システムを使用したリアルタイム流入速度と LDL コレステロールの取り込みを測定する効率的な方法を提供します。この手法は、細胞の形態およびそれ故に潜在的な細胞毒性を監視しながら LDL 流入に影響を与える化合物の薬理活性をスクリーニングするためのプラットフォームを提供します。

Abstract

来す介在性のエンドサイトーシスによって LDL コレステロール摂取量の規制は、代謝性疾患、心血管疾患、腎臓病などを含む様々 な主要な病態の研究の重要な領域です。現在、同時に細胞の健康を監視しながら LDL の取り込みを評価するために利用できるメソッドはありません。現在の研究は、細胞の健康の同時計測と LDL 流入のシリアル計測データを集録するライブセル イメージング解析システムを使用して、プロトコルを提示します。この手法は、4 時間コース以上 3 つのひと細胞株 (肝、腎の尿細管上皮、および冠動脈内皮細胞) でテストします。また、よく知られている LDL の取り込み阻害薬、Dynasore、組換え PCSK9 タンパク質だけでなく、LDL の取り込みプロモーター、シンバスタチンによるこの技術の感度が検証されます。一緒に取られて、このメソッドは、薬理活性を同時にスクリーニングとして細胞の形態、それ故の LDL の流入を調節する化合物の細胞毒性を監視中-高スループットのプラットフォームを提供します。分析は、さまざまなイメージング システムと解析ソフトウェアで使用できます。

Introduction

循環 LDL コレステロール値が心血管疾患1腎臓病2様々 な炎症性の中核となるので、LDL の低密度リポ蛋白質受容体を来すを介したエンドサイトーシスは研究の重要な領域疾患3やコレステロール輸送遺伝子4,5,6、7の変異と遺伝性疾患。来すを介したコレステロール流入の研究はダイナミン阻害剤など、化学 Dynasore8,9,10LDL を規制するなど、複数の研究ツールの識別につながっています。タンパク質などするプロタンパク質転換酵素サチライシン/Kexin は、9 (PCSK9)11,12を入力します。

LDL 来すエンドサイトーシス経路からクラスリン被覆ピット13に細胞表面の LDL を来すコンプレックスを封鎖始まります。空胞細胞内輸送のため LDL 来す複合体の内面表面細胞膜の陥入によって小胞を形成します。形成された小胞は初期と、後期エンドソームに成熟するので、その受容体14から LDL の脱退を引き起こし、後期エンドソーム内 pH が低下します。過去には、LDL の流入の定量化の方法は標識125– LDL 共同培養細胞および放射能標識タンパク質の定量15セル抽出以降に依存しました。これは、DiI LDL とその後の免疫染色などの蛍光標識 LDL タンパク質の使用または蛍光測定分光光度計またはプレート リーダー15,16を使用して蛋白質の抽出に置き換えられました。蛍光標識 LDL も使用されています蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えの LDL および細胞表面の LDL 結合17の内面化の分析のため。これらのメソッドは、処理後データの収集により中、治療中に細胞の生存率を監視することはできません。

後期エンドソームの酸性 pH は、pHrodo 内面18,19後蛍光を発する赤 LDL など pH 活性の蛍光 LDL プローブを使用できます。このプロパティは、生きた細胞の LDL の取り込み評価の連続時間コースできます。したがって、このプロトコルは細胞の健康の監視を同時に連続測定 LDL 取り込み生細胞における pHrodo 赤 LDL 蛍光イメージングを利用しています。3 つの異なるひと培養細胞、ひと肝臓癌 (hepg2 細胞) 細胞、ヒト腎上皮 (HK2) ひと冠動脈内皮細胞 (HCAEC で 4 時間経過テストとしてこの手法の信頼性が示唆します。).これらの細胞が LDL クリアランス20,21,22,23,24,25,26,27 に臨床的に重要です、腎臓疾患28,29,30,31, と心臓病32,33、それぞれ。LDL 流入の監視に加えこのプロトコルには 2 つのよく知られている LDL の取り込み阻害薬、Dynasore 水和物と PCSK9 の組換え蛋白質を来す式と LDL の取り込み、シンバスタチンのスタチン誘導と治療が組み込まれています。Dynasore と各 PCSK9 は LDL の吸収を減らすために様々 な経路を介して動作します。

Dynasore は、Dynamins10の小分子阻害薬、LDL を来す複雑な10,34のクラスリン依存性エンドサイトーシスをブロックすることによって LDL の取り込みを軽減されます。組換え PCSK9 ペプチダーゼを来すにバインドし、必要な構造変化3536,をブロックすることによって内面のコンプレックスから LDL を解放した後の細胞表面に、リサイクルを阻害する S8 家族のメンバーである一方で、.減少は細胞表面を来す密度は最終的に細胞によって減少 LDL の取り込みに します。スタチン系薬剤、3-ヒドロキシ-3-methylglutaryl-補酵素 (Hmg-coa) の還元酵素、従ってコレステロール生合成を直接ブロックしながら知られている上昇させることを来す25,38増加した LDL の取り込みにつながる表現。このプロトコルの感度は臨床的に関連する 3 つのひと細胞ライン、HK2、hepg2 細胞、HCAECs、Dynasore および/または組換え PCSK9、LDL 流入および HepG2 細胞の LDL の取り込みの顕著な増加で大幅な削減を検出することにより検証します。シンバスタチン細胞の形態/健康モニタリングと 4 時間コース。一緒に取られて、このメソッドは、薬理活性、生細胞における LDL の取り込みを調節する化合物の細胞毒性を同時にスクリーニングするための中・高スループットのプラットフォームを提供します。

Protocol

1. 24 ウェル プレートで細胞の播種 セルからメディアを吸引、Dubelco のリン酸緩衝生理食塩水 (dPBS) の 5 mL の細胞を洗浄し、吸引、dPBS。100 mm ディッシュの HepG2 細胞、0.25% の 1.5 mL を使用してトリプシン/EDTA HK2 セルまたは HCAECs 用 0.05%/トリプシン EDTA 溶液 1.5 mL のセルをデタッチするのには。 4 分またはセルを取り外すまでは、37 ° C の定温器でプレートを孵化させなさい。HCAEC 細胞の hepg2 細胞および HK2 またはトリプシン中和ソリューション、dPBS プラス 5% ウシ胎児血清 (FBS) の 3 mL 3 mL の完全培地を追加することによって 4 分インキュベーション後のトリプシンを中和します。 15 mL の円錐管にセルを転送し 5 分 250 × g で遠心分離、吸引、メディアおよび再完全なメディアで細胞ペレットを中断します。 細胞塊を破るに 40 μ m メッシュのストレーナを優しく細胞懸濁液をフィルターします。こし器を通して、細胞を洗浄しないでください。 セルをカウントし、最適化された密度でそれらをプレートします。たとえば、24 ウェル プレート HK2 セルまたは HCAECs の井戸あたり 10,000 細胞 HepG2 細胞のウェルあたり 5,000 の細胞は最適な結果に します。 プレートを付けるセルを許可する 37 ° C で一晩インキュベートします。 次の日、プラス 5% (FBS) なしのセル行のメディアをベースに携帯メディアを変更してリポ蛋白欠乏血清 (LPDS) または低 (2%)治療に応じて FBS メディア (1.7 を参照)。細胞を飢えさせて 24 時間培養を進みます。24 ウェル プレートのウェルあたりトータル メディアの 500 μ L を使用します。 3 つの方法の 1 つのセルの治療: rPCSK9 (または車両) の 10 μ G/ml を追加して 1 時間、37 ° C の定温器に細胞 Dynasore 水和物 (または車両、ジメチルスルホキシド) 40 μ M を追加して 10 分の 37 ° C の定温器にセルを返すを返す、または 1 μ M シンバスタチン (または車両、ジメチルスルホキシド) を追加し、37 ° C の定温器に 12、18、24 時間のセルを返します。5% のメディアを使用して、rPCSK9 や Dynasore の治療のための LPDS。使用低 (2%)FBS のメディアまたはメディアが 5 %lpds シンバスタチン治療。注: 必要な化合物とセルを扱う可能性がある時に行って、メディア変更のリポ蛋白飢餓 (ステップ 1.6) の長期的な実験や分析の前に短期間の実験のため。また、カスタマイズされた治療時間は種類や実験の目的に基づいて選択されるかもしれない。 次に、最終濃度 10 μ G/ml を取得する各ウェルに pHrodo 赤札 LDL (1 mg/mL 在庫) の 5 μ L を追加します。その後、井戸から任意の気泡を慎重に取り外します。 2. 生細胞解析 ラベルの LDL を追加した直後に生細胞解析システム インキュベーターでプレートを置き (材料の表を参照してください) でき、プレートの凝縮を減らすために 15 分間平衡にプレート。 一方で、ソフトウェアを開き、プレートを保持している容器を追加してスキャンをスケジュールします。画像 16 枚 10 X 赤と位相のチャンネルを使用して 4 時間で 1 時間間隔でも。 データ処理のために使用するプレート マップを作成します。 [プロパティ] タブをクリックしては、プレート マップを選択します。セルの種類と治療化合物] タブで入力します。 地域タブをクリックして、レプリケートの各セットを選択し、領域として保存します。 3. 解析パラメーターを設定します。 実験の実行が完了すると、コンピューターにカウント セットに含まれる各パラメーターを数値化するソフトウェアのイメージ セットを作成します。 ソフトウェアで、プレート ビューを開き、分析ジョブ ユーティリティボックスで作成またはイメージのコレクションに追加を選択します。 新しいイメージのコレクション、イメージ コレクションの名前を入力し、チャンネルの横にあるボックスをチェックして赤と位相のチャンネルを選択します。 5 より多くの画像を選択し、現在のイメージのコレクションへの追加、イメージのコレクションに追加します。 セルの処理定義を作成します。表 1には、この LDL 流入プロトコルの定義を処理 HCAE、HK2、hepg2 細胞セルのパラメーターが含まれています。 分析ジョブ ユーティリティボックスで新しい処理定義を選択します。ドロップ ダウン メニューから手順 2.1.2 で名前をイメージのコレクションを選択します。表 1からの細胞のタイプのパラメーターを入力します。 [プレビュー] ボックスに、プレビューのすべてを選択するのにドロップ ダウン メニューを使用します。 解析マスクボックスで合流マスクと赤いオブジェクト マスク] ボックス処理定義の分析に含まれている領域を表示するをチェックします。図 1を参照してください。 セルと LDL はマスクに含まれるようにイメージ コレクションをスクロールします。ファイルと処理定義を保存を選択します。 実験の実行からの画像のセットを分析します。 プレート ビューで実験を開きます。分析ジョブ ユーティリティボックスで新しい分析ジョブの起動を選択します。保存処理定義を選択します。 分析ジョブの名前、解析の時間範囲を選択、分析実験の井戸を強調します。起動ボタンをクリックします。 4. 解析およびデータ処理 分析ジョブが完了すると、データをエクスポートします。 完了した分析を選択し、表示を押します。ユーティリティメニューでメトリック/グラフをエクスポートを選択します。 地域メニューで選択すべての井戸とグループメニューを取得するグループとして井戸の各セットの平均値をレプリケートし、エクスポートするため各ウェルの個々 の値は、なし」を選択します。 赤オブジェクトのメトリックメニューで合計赤オブジェクト強度 (RCU x µm2/image)を選択します。このパラメーターは、細胞によって合計の LDL の取り込みに対応してそれぞれの十分のすべての画像 (μ2) で赤い信号の赤の信号強度 (RCU) で時間の合計を示します。 データのエクスポート] ボタンをクリックします。データを個別の画像に分割を確認します。データはクリップボードに自動的にコピーされますが、新しいスプレッドシート ファイルに貼り付けることができます。 位相物体メトリックメニューで合流 (パーセント)を選択します。データを個別の画像に分割を確認します。データのエクスポート] ボタンをクリックします。データが自動的にクリップボードにコピーされ、合計赤オブジェクトの統合された強度データを含むスプレッドシート ファイルをコピーすることができます。 パーセントの合流点の変換を次の方程式で総面積に適用されます。面積相 (μ m2/image) = 合流 (%) × (イメージの高さ (ピクセル単位) × 解像度) × (画像の幅 (ピクセル単位) × 解像度)注: 各ウェル内のセルの領域に対応する画像ごと位相領域のパーセントの合流を合流 (%) 示します。このメトリックは、各個人の総段階エリアに変換するか一度エクスポートされるイメージ。相チャネル (画像の高さ、幅、解像度) 各実験容器の上の式に使用するための画像の仕様は、画像チャンネル下容器プロパティを参照して見つけることが。 4.1.6 井戸の間で細胞密度の変動を排除するために各イメージに次の数式を使用しての計算された総相領域に合計赤オブジェクト統合された強度を標準化します。 画像ごとのLDL の取り込み (RCU)値を取得する、対応する面積相 (μ m2/image)で各画像の総赤オブジェクト強度 (RCU x µm2/image)値を除算します。 その後、各ウェルの平均の LDL の取り込みを取得し、グループを取得するすべてのレプリケート井戸の LDL の吸収値を平均する各ウェルのすべてのイメージのLDL の取り込み (RCU)データの平均値します。これらのデータは LDL の取り込みの最終的な値をイラストと好みのソフトウェアを使用して統計の分析に使用できます。

Representative Results

セルをライブ イメージングには 3 つのひと細胞コレステロール流入勉強中細胞の健康の信頼性の高い監視が可能になりますどのコレステロール恒常性調節はひと肝臓癌 (hepg2 細胞) 細胞、ひと腎上皮 (HK2) 細胞、ひと冠動脈内皮細胞など主要な病態生理学的役割を果たしている 3 つのひと細胞株における我々 の分析を検証しました(HCAECs)。我々 は 1 時間間隔でシリアル測定と 4 h 経過で LDL の取り込みアッセイを実行するのにライブセル イメージング システムを使用しました。テストすべてのセル型この手法と最終的なエンドポイント (図 2) として 4.33 h 流入調査の期間の連続の LDL の取り込みを示す曲線の結果と互換性があったことが示唆されました。図 2に示す流入データ合計 pHrodo の赤いラベル LDL 蛍光を正規化することで得られた (RCU x µm2 内の画像ごと赤いオブジェクトの統合された強度の合計/画像) 各画像にそれぞれの井戸 (μ 内の画像ごと位相オブジェクト領域の合計のセル領域にm2/image) 井戸の間で細胞密度の変動を排除します。さらに、LDL コレステロールの吸収に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするため LDL 流入アッセイの感度を検証するため、我々 は LDL の流入、Dynasore、rPCSK9 を阻害することが知られて 2 つのポジティブ コントロールと LDL を誘導するために知られている 1 つの肯定的な制御を使用取り込み、シンバスタチン。検証の結果、Dynasore と rPCSK9、治療によりすべての 3 つは 4 h の時間経過 (図 2の C) LDL 流入の著しい縮小を示しましたひと細胞ライン (HepG2、HK2、HCAEC) をテストしました。たとえば、図 2Aは、DMSO; 処理細胞と比較して時間経過 Dynasore の治療の HepG2 細胞における LDL 流入が削減できることを示していますコントロールはコントロール群に比べて LDL 流入に重大な影響がなかった Dynasore の車両コントロールとして DMSO 中。さらに、我々 の調査結果は、シンバスタチン (図 3) による治療、LDL 流入の重要な変化を検出するこの方法の感度を支える HepG2 細胞の LDL の取り込みでマークされた増加を示した。LDL 取り込み研究で典型的な時点で、4.5 h の時点について LDL 流入が大幅 Dynasore または rPCSK9 のいずれかの治療を減らす、シンバスタチン治療 (図 4) によって増加しました。 LDL の取り込み研究のイメージングを使用する主要な利点はこのシステムが検討した化合物の潜在的な細胞毒性を監視するために使用できる各ウェルの細胞のリアルタイム画像を提供します。図 5-7は、初期時点 (0.33 h) と最終的なエンドポイント (4.33 h) で純の LDL 流入の視覚的な基準として調査 3 つのセルラインの代表的なイメージを示しています。画像は、Dynasore または rPCSK9 の治療、有効性およびこれらの化合物の安全性を示す細胞の通常の形態を確認します。 生細胞分析を与える信頼性の高いシリアル定量的コレステロール流入測定様々 な治療法 ライブセル イメージング システムにこのプロトコルを使用しての主な利点は、時間期間全体のデータを収集し、として従来行われてちょうど 1 つの最終的な時間ポイントよりもむしろ複数の時点で LDL 流入を比較する機能です。パーセント減 LDL 流入時間コース中 1 h 間隔でだけでなく、ターミナルの時点で計算することがこのプロトコルを使用しております。表 2にまとめます 40 μ m 10 分前処置に続く 3 つのテストのひと培養細胞における LDL 流入の減少 Dynasore または 1 h 10 μ G/ml rPCSK9 の前処理。最終的な研究の終了点として 4.33 h で 40 μ M で Dynasore と治療が 53%、68%、54%、それぞれ(表 2 a ~ C) HCAECs、HK2 細胞 HepG2 細胞における LDL 流入を大幅に削減、10 μ g/mL で rPCSK9 と治療結果、LDL 55% 削減HK2 の流入は細胞(表 2 b)。伝統的な試金のようにターミナル時点の定量化、に加えて実験の各時点で治療のため LDL 流入低減の定量分析を行うことができるがおります。たとえば、表 2Bは、3.33 h で 59% は未処理の細胞と比較して治療を投稿 HK2 1.33 h で 79%、2.33 h で 67 %ldl の取り込みの低下した細胞の rPCSK9 治療を示しています。このプロトコルは、治療後の LDL 流入の定量分析のための信頼性の高い方法を提供します。 図 1: 定義マスクを処理します。HK2 細胞の代表的なイメージは、次の (表 1に詳述) 適切な処理定義のアプリケーション描かれています。赤に適用されるオブジェクト マスク (C) またはフェーズと赤オブジェクト マスクの適用 (D) 相 Maskapplied (B) と (A) をマスキングなし areHK2 細胞で示します。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: 4.33 h 時間経過とともに LDL の取り込みを使用してライブの削減セル イメージング システム。細胞解析システムは、ひと肝臓癌 (hepg2 細胞) 細胞 (A)、ヒト腎尿細管上皮 (HK2) 細胞 (B) ひと冠動脈内皮 (HCAE) 細胞 (C) LDL 流入を測るためのライブします。セルは、Dynasore (実行前に 10 分) または rPCSK9 (実行前に 1 h) とポジティブ コントロールとして扱われました。DMSO は Dynasore の処置のための車両として使用されました。ポジティブ コントロールにはすべて 3 細胞における LDL 流入が減少。総段階のオブジェクト領域 (μ m2/image) に統合された合計の赤いオブジェクト強度 (RCUxµm2/image) を正規化することで得られた LDL 流入値。データは、mean±SEM。 N = 6 井戸/グループ。データは、2 または 3 つの独立実験の代表です。p < 0.0001 vs 空と ###p < 0.0001 対 DMSO、二元を使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3.4.33 h 時間経過システムをイメージングを使用して LDL の取り込みの増加。ライブ細胞分析 (HEPG2) ひと肝癌細胞における LDL 流入を測定するシステムを使用します。LDL の取り込みが 2% を含むメディアを使用して (A) 12 h、18 h (B) または (C) 24 h のシンバスタチンと治療の後大幅に増加政府短期証券。24 h 時間ポイントを 5% を含むメディアも行った (せずに FBS) LPDS。DMSO は、ネガティブ コントロールとして使用されました。総段階のオブジェクト領域 (μ m2/image) に統合された合計の赤いオブジェクト強度 (RCU x µm2/image) を正規化することで得られた LDL 流入値。データは、mean±SEM。 N = 6 井戸/グループ。データは、1 つの独立した実験の代表です。p < 0.0001 対 DMSO、スチューデントの t 検定を使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4.4.3 h 時点で LDL の取り込みを低下させるエージェントによって重要な LDL の流入減少します。ひと冠動脈内皮 (HCAE) 細胞 (C) を次の LDL の取り込みによる治療、ヒト腎尿細管上皮 (HK2) 細胞 (B)、(HepG2) ひと肝癌細胞 (A) LDL 流入を大幅に削減します。10 分または 1 時間の rPCSK9 の Dynasore の抑制剤。LDL の流入が著しく増 HepG2 細胞におけるシンバスタチン 12、18 または 24 h 治療 (D) 後。データは、mean±SEM。 N = 6 井戸/グループ。データは、2 または 3 つの独立実験の代表です。p < 0.0001 二元を使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5.LDL の取り込みを低下させるエージェント、Dynasore による肝細胞癌 (hepg2 細胞) 細胞の LDL 流入を減少します。位相物体と HepG2 細胞の赤いオブジェクトの代表的なイメージは 0.33 h (左のパネル) に描かれ、4.33 h エンドポイント (右側のパネル) 細胞の健康状態を表示します。40 μ M Dynasore、LDL コレステロールの吸収を減らすために知られている肯定的な制御 (C) として使用されました。画像は、10 倍の倍率で撮影されました。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 6.ヒト腎尿細管上皮 (HK2) 細胞 LDL の取り込みを低下させるエージェント、Dynasore および rPCSK9 によって LDL の流入を減少します。位相物体と HK2 セル 0.33 h (左のパネル)、4.33 h エンドポイント (右側のパネル) に描かれている赤い物体の代表的なイメージは、細胞の正常な状態を表示します。40 μ M Dynasore (C) または 10 μ G/ml rPCSK9 (D)、LDL コレステロールの吸収を減らすために知られている肯定的な制御として使用されました。画像は、10 倍の倍率で撮影されます。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 7.LDL の取り込みを低下させるエージェント、Dynasore によるひと冠動脈内皮細胞 (HCAECs) の LDL の流入を減少します。位相物体と 0.33 h (左のパネル)、4.33 h エンドポイント (右側のパネル) で描かれた HCAECs の赤いオブジェクトの代表的なイメージは、細胞の正常な状態を表示します。40 μ M Dynasore、LDL コレステロールの吸収を減らすために知られている肯定的な制御 (C) として使用されました。画像は、10 倍の倍率で撮影されました。スケールバー = 100 μ m のデータは mean±SEM。 N = 6 井戸/グループ。データは、2 または 3 つの独立実験の代表です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 表 1: 定義パラメーターを処理します。これらのパラメーターは、このプロトコルで使われる分析システムに固有です。パラメーターは、赤のチャンネルに赤い領域と相チャネル内のセルの領域を分析するを設定する必要があります。HK2、HepG2 のパラメーター設定 HCAE セルラインが掲載されています。 表 2: 4.3 h で Dynasore、rPCSK9、またはシンバスタチンと処理 HCAE、HK2 HepG2 細胞における LDL 流入のパーセントの変化(A) HepG2 細胞、(B) HK2 細胞、(C) HCAE セル、および (D) HepG2 細胞。

Discussion

現在のプロトコルでは、様々 なひと細胞株における経時的リアルタイム LDL の取り込みを測定するための新しいより効果的な方法としての生きているセルイメージ投射の使用率を示しています。ひと肝臓癌 (hepg2 細胞) 細胞はコレステロール値を下げる治療21,22,23,24,25,26、検診研究でよく使用されます。 39,40。したがって、LDL 流入研究生細胞イメージング システムの機能をテストするためこの型のセルを選んだ。我々 の結果 HepG2 細胞がこの新しい技術と最終的なエンドポイントとして 4.33 h まで流入試金の持続期間のための連続の LDL の取り込みを示すようなシグモイド曲線の結果と互換性があることを示す (図 2 aおよび図 3 ).

コレステロール恒常性は、様々 な nephropathies の病態において主要な役割を果たします。確かに、腎組織にコレステロールが蓄積は慢性腎臓病につながる腎線維化への主要コントリビューターは、様々 な nephropathies28,29,30,31の主要な病理。したがって、腎臓の分野で利用されている人気のある、信頼性の高いセルラインとしてヒト腎上皮 (HK2) で調べた。我々 のデータはまた HK2 細胞における LDL 流入を測定するライブセル イメージング システムの実現性をサポートしました。図 2Bに示すよう HK2 細胞流入研究 (4 時間) の期間を通じて直線的 LDL コレステロールを取り上げた。

開発とアテローム性動脈硬化32,33,41、世界ナンバーワン キラーは、心血管疾患の主要な原因の進行におけるコレステロール代謝の重要性のため42、動脈硬化に関連するセル型の手法を検証する目的とします。これらは動脈硬化症患者の冠動脈内腔でコレステロール侮辱にさらされる最初のセル型の 1 つとひと冠動脈内皮細胞 (HCAECs) を使いました。図 2Cに示すように、データは、この LDL 流入メソッドは、また効果的に HCAECs で動作することを示します。結果のグラフは HepG2 細胞のような s 状結腸のような曲線です。

LDL 流入の試金の改善から、この LDL コレステロールの吸収に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするための有効性をテストするには、3 つのコントロール、LDL の取り込みを低下させるエージェント Dynasore と rPCSK9、および LDL 流入活性剤シンバスタチンを使いました。ここでは、我々 は上記治療細胞 (HepG2、HK2 と HCAECs) Dynasore または流入分析の前に rPCSK9 の最適濃度を記載。私たちの結果は、3 つすべてのテスト細胞が 4 時間コース (図 2) LDL 流入の大幅な削減と治療に反応します。例えば、最終時点として 4.33 h で 40 μ M で Dynasore 処理大幅に削減 53%、68%、54%、HCAECs、HK2 細胞 HepG2 細胞における LDL 流入それぞれ (p < 0.0001;図 2A Cと表 2 a ~ C)。また、10 μ g/mL で rPCSK9 HK2 細胞における LDL 流入でマーク付きの 55% 減少の原因 (p < 0.0001;図 2Bと表 2B)。また、我々 の調査結果は LDL 流入の重要な変化を検出するこの方法の感度を支える LDL の取り込み (図 3) の顕著な増加の結果とシンバスタチン HepG2 細胞の治療を示した。RPCSK9 はよくとり上げられる結果と追加のコントロール治療として使用されますが、少量で購入する高価な hepg2 細胞および HCAEC 細胞における rPCSK9 による治療の研究はこのプロトコルには含まれておりません。したがって rPCSK9 HK2 セルでこのプロトコルの検証に使われました。

LDL 流入、細胞の形態と健康の継続的な監視に使用できる機能性とタイムリーな測定に伴い、ライブセル イメージングを住んでいます。この利点は効率的に作るこのメソッドの薬理作用と細胞毒性を同時に監視するための理想的なテクニック、応用化合物の潜在的な細胞毒性を検出できます。図 5-7純 LDL 流入に対する治療法の効果を視覚的な基準として最終的なエンドポイント (4.33 h) で 3 つのテスト細胞の代表的なイメージを示すし、また次のテスト細胞の健康的な形態を示していますトリートメント。研究の持続期間のためのセルのヒースイー形態を保証するために各ウェルからのすべての画像の目視検査をお勧めします。HepG2 細胞のイメージが 80 μ M と扱われるとき、表示されないデータでたとえば、Dynasore が検査された、我々 は細胞の剥離の兆候を観察プレートを持ち上げて、その高濃度細胞の剥離を示唆するセルの端が登場しました。Dynasore。さらに、高用量スタチン45の報告された高濃度シンバスタチン (3-10 μ M) はまた変更された形態を示すにつながったがアポトーシス。このプロトコルは 20-80 μ m Dynasore 治療とシンバスタチン 0.5-10 μ M の濃度で細胞の健康を分析し、治療の潜在的な ctotoxicity を決定する使用された細胞像を次の滴定を行うため様々 な濃度。結果は、至適濃度として Dyansore とシンバスタチンの 1 μ M のため 40 μ M の使用を提案しました。

最後に、ウェルあたり一貫性のある結果を得るための最適な携帯番号を識別するためにこのメソッドをテストする別の細胞株は細胞密度滴定法の研究を実行することをお勧めします。私たちの細胞密度の最適化研究は、細胞/ウェル 24 ウェル プレートで 10,000 が HK2 と HCAE セルの一貫性の LDL 流入成果につながることを示した。この LDL 流入アッセイは、生細胞イメージング システムを使用して、ため井戸に均等に分散非合流細胞の単層が望ましい細胞の塊が正規化された LDL 流入の最終的な値のエラーを生む可能性がありますに注意してくださいすることが重要です。これの理由は、流入データの正規化、位相オブジェクト領域は細胞密度の測定として使用細胞塊が形成されるときにこのパラメーターことができます悪影響影響します。HepG2 細胞に 5,000 細胞/ウェルを引き起こす矛盾した流入の結果よりも高い密度で播種するときフォーム群生する傾向があることがわかったしたがって、我々 5,000 セル 24 ウェル プレートのウェルあたりとして使用最適密度 HepG2 細胞の。

総称して、本手法は、薬理活性と同時に LDL の流入を調節する化合物の細胞毒性スクリーニング中-高スループット プラットフォームを提供します。このメソッドは、リアルタイムで配位子吸収を評価するライソゾームのコンパートメントを入力その他の蛍光標識したリガンドで使用するために容易に適応することができます。このプロトコルを提供しています InCucyte の仕様のライブ ・ イメージングと解析システム プロトコルは Cellomics などの代替画像に合わせることができます。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、ラスベガスに次の補助金によって支えられた: 国立衛生研究所の (R56HL132209 および 1R01HL140468) およびマイアミの心研究所。KY はアメリカ心臓協会また、博士課程フェローシップ (18PRE33960070) の受信者です。HepG2 細胞親切、博士エマニュエル ・ トーマス、マイアミ大学ミラー医学46,47,48の学校によって提供されました。

Materials

pHrodo Red-LDL ThermoFisher Scientific L34356
HepG2 cells E. Thomas Lab, U. Miami HB-8065
MEM Sigma M0325
Sodium Pyruvate Sigma P5280
L-Glutamine 200mM solution Sigma G7513
FBS Atlas Biologicals FP-0500-A
HK2 cells ATCC CRL-2190
Keratinocyte SFM media kit Gibco 17005-042
Primary Coronary Artery Endothelial Cells ATCC PCS-100-020
Vascular Cell Basal Medium ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF ATCC PCS-100-041
Human Lipoprotein Deficient Serum Millipore LP4
PBS Sigma D8537
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056
Trypsin-EDTA (0.05%) Gemini Bio-Products 400-150
Trypsin Neutralizing Solution ATCC PCS-999-004
24 well plate Falcon 353226
40 μM mesh cell strainer VWR 10199-654
15 mL conical tubes VWR 89039-666
50 mL conical tubes VWR 89039-658
Trypan Blue Staining (0.4%) Life Technologies T10282
Counting Slides Bio-Rad 145-0011
Incucyte Zoom Sartorius Zoom Imaging and analysis platform
Dynasore Hydrate Sigma D7693
PCSK9 Recombinant Protein Cayman Chemicals 20631
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References

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Ritter, P., Yousefi, K., Ramirez, J., Dykxhoorn, D. M., Mendez, A. J., Shehadeh, L. A. LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring. J. Vis. Exp. (141), e58564, doi:10.3791/58564 (2018).
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