Denne protokollen gir en effektiv tilnærming til måling LDL Kolesterol opptak med sanntid tilstrømningen priser ved bruk av en levende celle imaging system i ulike celletyper. Denne teknikken gir en plattform til skjermen farmakologiske aktiviteten av stoffer påvirker LDL tilstrømningen under overvåking av cellen morfologi og dermed potensielle cytotoksisitet.
Regulering av LDL Kolesterol opptak gjennom LDLR-mediert endocytose er et viktig område av studiet i ulike store patologi inkludert stoffskiftesykdom, hjerte-og karsykdommer og nyresykdom. Aktuelle, finnes det ingen tilgjengelig metode å vurdere LDL opptak mens samtidig overvåking for helse av cellene. Denne studien presenterer en protokoll, ved hjelp av en levende celle tenkelig analysesystem for å skaffe føljetong målinger av LDL tilstrømningen med samtidige overvåking for celle helse. Denne teknikken er testet i tre humane cellelinjer (lever, nyre rørformede epitel og coronary arterien endotelceller) over en fire-timers kurs. Videre er følsomheten på denne teknikken validert med kjente LDL opptak hemmere, Dynasore og rekombinant PCSK9 protein, samt av en LDL opptak arrangøren, Simvastatin. Samlet gir denne metoden en middels til høy gjennomstrømming plattform samtidig screening farmakologisk aktivitet, samt overvåking av cellen morfologi, derav cytotoksisitet forbindelser regulere LDL tilstrømningen. Analysen kan brukes med forskjellige imaging-systemer og analytisk programvare.
Lav tetthet Lipoprotein reseptoren LDLR-mediert LDL endocytose er et viktig område av studiet siden sirkulerende LDL kolesterol nivåer er i kjernen av hjerte-og karsykdommer1, nyre sykdom2 samt en rekke inflammatorisk sykdommer3 og genetiske lidelser mutasjoner i kolesterol transport gener4,5,6,7. Studier i LDLR-mediert kolesterol tilstrømningen har ført til identifikasjon av flere forskningsverktøy, for eksempel Dynamin hemmere inkludert den kjemiske Dynasore8,9,10, samt LDL-regulere proteiner som Proprotein konvertasene Subtilisin/Kexin skriver 9 (PCSK9)11,12.
LDL-LDLR endocytose veien begynner med sequestering LDL-LDLR komplekset på celleoverflaten til clathrin-belagt groper13. Blemmer blir da dannet av invagination i cellemembranen for overflate som introvert LDL-LDLR komplekset i vacuoles transport i cellen. Som dannet vesicle modnes i tidlige og deretter sene endosomes, drops pH inne det sen endosome, forårsaker tilknytningene til LDL fra sin reseptor14. Tidligere avhengig metoder for kvantifisering av LDL tilstrømningen av radio-merket 125-LDL co inkubasjon celler og påfølgende utvinning av radio-merket protein fra celler for kvantifisering15. Dette ble så erstattet av bruk av fluorescently merket LDL proteiner som DiI-LDL, og etterfølgende immunostai- eller utvinning av protein for fluorescerende avlesninger med et spektrofotometer eller plate leser15,16. Fluorescently merket er LDL også brukt i fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) for analyse av internalization LDL og celle overflaten LDL bindende17. Mens disse metodene tillater samling data etter behandling, er overvåke levedyktigheten til cellene under behandling ikke mulig.
Surt pH i slutten endosome tillater bruk av en pH-aktivert fluorescerende LDL sonde som pHrodo rød LDL som fluoresces etter internalisering18,19. Denne egenskapen gir en sammenhengende tid selvfølgelig LDL opptak vurdering i levende celler. Derfor utnytter denne protokollen pHrodo Red-LDL fluorescens imaging i en levende celle analyse til serielt mål LDL opptak med samtidige overvåking for celle helse. Resultatene tyder påliteligheten av denne teknikken som testet over en fire-timers kurs i tre forskjellige humane cellelinjer, menneskelige nedsatt carcinoma (HepG2) celler, menneskelige nyre (HK2) epitelceller og menneskelige koronar arteriell endotelceller (HCAEC ). Disse linjer er klinisk signifikant til LDL klaring20,21,22,23,24,25,26,27 , nyre sykdom28,29,30,31og hjertesykdommer32,33, henholdsvis. I tillegg til overvåking LDL tilstrømningen, innlemmer denne protokollen behandling med to kjente LDL opptak hemmere, Dynasore hydrat og rekombinant PCSK9 protein samt et statin induser av LDLR uttrykk og LDL opptak, simvastatin. Dynasore og rekombinant PCSK9 hver arbeid gjennom ulike stier å redusere LDL opptak.
Dynasore er et lite molekyl hemmer Dynamins10 , og reduserer LDL opptak ved å blokkere clathrin-avhengige endocytose av LDL-LDLR komplekse10,34. Rekombinant PCSK9, derimot, er medlem av peptidase S8 familie som binder seg til LDLR og hemmer dens resirkulering til celleoverflaten etter frigir LDL fra internalisert komplekset blokkerer nødvendige conformational endringene35,36 . Redusert cellen overflaten LDLR tetthet fører til slutt til redusert LDL opptak av cellen. Statiner, kjent mens direkte blokkerer 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzym (HMG-CoA) reduktase enzymet og dermed kolesterol biosyntesen, også for å upregulate uttrykk for LDLR25,38 fører til økt LDL opptak. Følsomhetsnivået til denne protokollen valideres av oppdager betydelige reduksjoner i LDL tilstrømning av tre klinisk relevante humane cellelinjer, HK2, HepG2 og HCAECs, Dynasore og/eller rekombinant PCSK9, og en markant økning LDL opptak i HepG2 celler av Simvastatin i en fire-timers kurs med overvåking av cellen morfologi/helse. Samlet gir denne metoden en middels til høy gjennomstrømming plattform for samtidig screening farmakologisk aktivitet og cytotoksisitet forbindelser regulere LDL opptak i live celler.
I gjeldende protokollen viser vi utnyttelsen av levende celle imaging som en ny og mer effektiv metode for å måle sanntid LDL opptak en gang løpet i ulike humane cellelinjer. Menneskelige nedsatt carcinoma (HepG2) celler blir ofte brukt i studier screening for kolesterolsenkende therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Derfor valgte vi dette celle type for å teste funksjonaliteten til en levende celle tenkelig system for LDL tilstrømningen studier. Våre resultater viser at HepG2 celler er kompatibel med denne nye teknikken og resultere i en sigmoid-lignende kurve som angir kontinuerlig LDL opptak for varigheten av tilstrømningen analysen til 4.33 h som siste sluttpunktet (figur 2A og Figur 3 ).
Kolesterol homeostase spiller en viktig rolle i Patofysiologien ved ulike nephropathies. Faktisk kolesterol akkumulering i nyre vev er en stor bidragsyter til nyre fibrose fører til kronisk nyresykdom og er en stor patologi i ulike nephropathies28,29,30,31. Derfor, undersøkte vi vår metode i menneskelig nyre (HK2) epitelceller som en populær og pålitelig cellen linje benyttes innen nephrology. Våre data også støttet muligheten av levende celle tenkelig system for å måle LDL tilstrømning av HK2 celler. Som vist i figur 2B, tok HK2 celler LDL Kolesterol lineært gjennom hele tilstrømningen studien (4 timer).
På grunn av viktigheten av kolesterol stoffskiftet i utvikling og progresjon av aterosklerose32,33,41, den ledende årsaken til hjerte sykdom, som igjen er den fremste killer verdensomspennende 42, vi som mål å validere vår metode i en aterosklerose relevante celle type. Vi brukte menneskelige koronar Arterial endotelceller (HCAECs), da disse er en av de første celletyper utsettes et kolesterol fornærmelse i koronar lumen av en aterosklerose pasient. Våre data vises i figur 2C indikerer at denne LDL tilstrømningen metoden også fungerer effektivt med HCAECs. Resulterende grafen er en sigmoid-lignende kurve lik som HepG2 celler.
For å teste gyldigheten og følsomhet for denne forbedret LDL tilstrømningen analysen for screening forbindelser påvirker LDL-Kolesterol opptak, brukte vi tre kontroller, LDL opptak-senkende medikamenter Dynasore og rPCSK9 og LDL tilstrømningen aktivator Simvastatin. Her vi behandlet ovenfor nevnte linjer (HepG2, HK2 og HCAECs) med optimalisert konsentrasjoner av Dynasore eller rPCSK9 før tilstrømningen analysen. Resultatene viste at alle tre testet cellelinjer svarte på behandlinger med betydelige reduksjoner i LDL tilstrømningen over en 4-timers kurs (figur 2). For eksempel, på 4.33 h som siste gang, behandling med Dynasore på 40 µM betydelig redusert LDL tilstrømningen i HepG2 celler og HK2 celler HCAECs 53%, 68% og 54%, henholdsvis (p < 0,0001; Figur 2 A-C og Tabellen 2A-C). I tillegg rPCSK9 på 10 µg/mL forårsaket en markert 55% reduksjon i LDL tilstrømning av HK2 celler (p < 0,0001; Figur 2 B og tabellen 2B). Dessuten viste våre funn at behandling av HepG2 celler med Simvastatin resulterte i en markert økning i LDL opptak (Figur 3), støtter følsomhetsnivået til denne metoden å oppdage viktige endringer i LDL tilstrømningen. Studier av behandling med rPCSK9 i HepG2 og HCAEC celler er ikke inkludert i denne protokollen rPCSK9 brukes som en ekstra kontroll behandling med godt dokumenterte resultater, men er kostbart å kjøpe i små mengder. Derfor ble rPCSK9 bare brukt til å validere denne protokollen i HK2 celler.
Live celle imaging analyse, sammen med funksjonell og rettidig måling av LDL pågangen, tillatt for kontinuerlig overvåking av helse og morfologi av cellene. Denne fordelen kan effektivt oppdage potensielle cytotoksisitet av anvendt forbindelser, gjør denne metoden en ideell teknikk for samtidig overvåking farmakologisk aktivitet og cytotoksisitet. Tallene 5-7 illustrerer representant bilder av tre testet celle linjene på siste sluttpunktet (4.33 h) som en visuell referanse for effekten av behandlinger på netto LDL tilstrømningen og viser også sunn morfologi av cellene etter den testet behandlinger. Vi anbefaler visuell inspeksjon av alle bildene fra hver brønn å sikre heathy morfologi av cellene for varigheten av studien. For eksempel i data ikke vises, når bilder av HepG2 cellene behandlet med 80 μM Dynasore ble kontrollert, observerte vi indikasjoner på cellen avdeling som kantene av cellene syntes å løfte av platen, tyder celle avdeling på høyere konsentrasjoner av Dynasore. Videre indusert høye konsentrasjoner av simvastatin (3-10 μM) førte også til endrede morfologi indikerer apoptose som rapporterte høye doser av statiner45. Denne protokollen ble brukt til å utføre en titrering Dynasore behandling på 20-80 μM, og Simvastatin på 0,5-10 μM konsentrasjon, etter celle bildene ble brukt til å analysere tilstanden til cellene og se potensielle ctotoxicity behandlingene på ulike konsentrasjoner. Resultatene foreslått bruk av 40 μM for Dyansore og 1 μM for simvastatin optimal konsentrasjoner.
Til slutt anbefaler vi utfører en celle tetthet titrering studie hvis en annen celle testes med denne metoden for å finne det optimale celle nummeret per brønn for å oppnå konsistente resultater. Vår celle tetthet optimalisering studie viste at 10.000 celler/godt i en 24-vel plate føre til konsekvent LDL tilstrømningen resultater for HK2 og HCAE celler. Det er viktig å merke seg at for denne LDL tilstrømningen analysen med levende celle tenkelig system, en monolayer av ikke-confluent celler jevnt fordelt på brønnene er ønskelig som klumper av celler kan gi opphav til feil i normalisert LDL tilstrømningen sluttverdiene. Grunnen til dette er at for normalisering av tilstrømningen dataene, fase området brukes som et mål på cellen tetthet og denne parameteren kan påvirkes negativt når cellen klumper er dannet. Vi observerte at HepG2 celler har en tendens til danner klumper når seeded på tettheter høyere enn 5000 celler/vel forårsaker strid tilstrømningen resultater; Derfor brukte vi 5000 celler per brønn i en 24-vel plate som optimal tetthet for HepG2 celler.
Kollektivt, gir vår metode en middels til høy gjennomstrømming plattform for screening farmakologisk aktivitet og cytotoksisitet forbindelser regulere LDL tilstrømningen samtidig. Denne metoden kan være lett tilpasset for bruk med andre fluorescently-merket ligander angir lysosomale rommet for å evaluere ligand opptak i sanntid. Mens denne protokollen tilbyr spesifikasjoner for InCucyte live bildebehandling og analysesystem protokollen kan tilpasses for alternative tenkelig systemer som Cellomics.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av følgende tilskudd til LAS: National Institute of Health (R56HL132209 og 1R01HL140468) og Miami hjertet Research Institute. KY er en mottaker av American Heart Association Predoctoral fellesskap (18PRE33960070). HepG2 celler fotograferingen av Dr. Emmanuel Thomas, Universitetet i Miami-Miller skolen av medisin46,47,48.
pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
MEM | Sigma | M0325 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
24 well plate | Falcon | 353226 | |
40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |