इस प्रोटोकॉल वास्तविक समय आमद विभिंन प्रकार के सेल में एक जीवित सेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर दरों के साथ एलडीएल कोलेस्ट्रॉल को मापने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है । यह तकनीक कोशिका आकृति विज्ञान और इसलिए संभावित cytotoxicity के लिए निगरानी करते हुए एलडीएल आमद को प्रभावित करने वाले यौगिकों की औषधीय गतिविधि को स्क्रीन करने के लिए एक मंच प्रदान करता है ।
LDLR-मध्यस्थता endocytosis के माध्यम से एलडीएल कोलेस्ट्रॉल की अधिकता का विनियमन चयापचय विकार, हृदय रोग, और गुर्दे की बीमारी सहित विभिन्न प्रमुख विकृतियों में अध्ययन का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है । वर्तमान में, वहां कोई उपलब्ध विधि के लिए एलडीएल का आकलन करते हुए एक साथ कोशिकाओं के स्वास्थ्य के लिए निगरानी । वर्तमान अध्ययन एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, एक जीवित सेल इमेजिंग विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर, कोशिका स्वास्थ्य के लिए समवर्ती निगरानी के साथ एलडीएल आमद के धारावाहिक माप प्राप्त करने के लिए । इस उपंयास तकनीक तीन मानव कोशिका लाइनों (यकृत, गुर्दे ट्यूबलर उपकला, और कोरोनरी धमनी endothelial कोशिकाओं) में एक चार घंटे के समय पाठ्यक्रम पर परीक्षण किया है । इसके अलावा, इस तकनीक की संवेदनशीलता अच्छी तरह से जाना जाता है एलडीएल के साथ पुष्टि की है, Dynasore और रिकॉमबिनेंट PCSK9 प्रोटीन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक एलडीएल को बढ़ावा देने के द्वारा, Simvastatin । एक साथ ले लिया, इस विधि एक माध्यम से उच्च प्रवाह के लिए एक साथ औषधीय गतिविधि स्क्रीनिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल आकृति विज्ञान की निगरानी, इसलिए cytotoxicity के लिए एलडीएल आमद विनियमित यौगिकों प्रदान करता है । विश्लेषण अलग इमेजिंग प्रणालियों और विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है ।
कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर (LDLR)-मध्यस्थता एलडीएल endocytosis अध्ययन का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र के बाद से घूम रहा है एलडीएल कोलेस्ट्रॉल के स्तर हृदय रोग1के कोर में हैं, गुर्दे की बीमारी2 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भड़काऊ की एक किस्म 3 रोगों और कोलेस्ट्रॉल परिवहन जीन में उत्परिवर्तनों के साथ आनुवंशिक विकारों4,5,6,7। LDLR में अध्ययन-मध्यस्थता कोलेस्ट्रॉल आमद कई अनुसंधान उपकरण की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया है, रासायनिक Dynasore सहित Dynamin अवरोधकों के रूप में8,9,10, साथ ही एलडीएल-विनियमन प्रोटीन Convertase Subtilisin/Kexin प्रकार 9 (PCSK9)11,12.
एलडीएल-LDLR endocytosis मार्ग sequestering के साथ शुरू होता है एलडीएल LDLR परिसर में सेल की सतह पर clathrin-लेपित गड्ढ़े13। बुलबुले तो कक्ष के अंदर परिवहन के लिए रिक्तिकाएं में एलडीएल-LDLR परिसर internalizing कोशिका सतह झिल्ली के invagination द्वारा गठित कर रहे हैं । के रूप में गठित पुटिका जल्दी में परिपक्व और फिर देर endosomes, पीएच देर endosome के अंदर चला जाता है, इसके रिसेप्टर14से एलडीएल के कारण । अतीत में, एलडीएल आमद के ठहराव के तरीके रेडियो लेबल पर निर्भर १२५I-एलडीएल सह कोशिकाओं और ठहराव15के लिए कोशिकाओं से रेडियो लेबल वाले प्रोटीन के बाद निष्कर्षण के साथ मशीन । यह तो जैसे दिी-एलडीएल के रूप में फ्लोरोसेंट लेबल एलडीएल प्रोटीन के उपयोग की जगह थी, और बाद में immunostaining या फ्लोरोसेंट रीडिंग के लिए प्रोटीन की निकासी एक spectrophotometer या प्लेट रीडर15,16का उपयोग कर । फ्लोरोसेंट लेबल एलडीएल भी प्रतिदीप्ति में इस्तेमाल किया गया है सक्रिय कक्ष छंटाई (FACS) के internalization के विश्लेषण के लिए एलडीएल और सेल की सतह एलडीएल बाध्यकारी17। जबकि इन पद्धतियों के उपचार के बाद डेटा के संग्रह के लिए अनुमति देते हैं, उपचार के दौरान कोशिकाओं की व्यवहार्यता की निगरानी संभव नहीं है ।
देर endosome में अंलीय पीएच के उपयोग की अनुमति देता है एक पीएच-इस तरह के pHrodo लाल एलडीएल के रूप में फ्लोरोसेंट एलडीएल जांच सक्रिय है कि18internalization,19के बाद fluoresces । यह गुण लाइव कोशिकाओं में एलडीएल का लगातार मूल्यांकन करने के लिए एक निरंतर समय के पाठ्यक्रम के लिए अनुमति देता है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल एक जीवित कोशिका विश्लेषण में pHrodo लाल-एलडीएल प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करता है प्रश्नपत्र कोशिका स्वास्थ्य के लिए समवर्ती निगरानी के साथ एलडीएल को मापने के उपाय । परिणाम तीन अलग मानव कोशिका लाइनों, मानव यकृत कार्सिनोमा (HepG2) कोशिकाओं, मानव गुर्दे उपकला (HK2) कोशिकाओं और मानव कोरोनरी धमनी endothelial कोशिकाओं में एक चार घंटे का समय पाठ्यक्रम पर परीक्षण के रूप में इस उपंयास तकनीक की विश्वसनीयता का संकेत (HCAEC ). इन सेल लाइनों के लिए नैदानिक महत्वपूर्ण है एलडीएल मंजूरी20,21,22,23,24,25,26,27 , गुर्दे की बीमारी28,29,30,31, और हृदय रोग३२,३३, क्रमशः । एलडीएल आमद की निगरानी के अलावा, इस प्रोटोकॉल दो अच्छी तरह से ज्ञात एलडीएल के साथ इलाज शामिल हैं, Dynasore हाइड्रेट और रिकॉमबिनेंट PCSK9 प्रोटीन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से LDLR अभिव्यक्ति और एलडीएल के एक statin उत्प्रेरण, simvastatin । Dynasore और रिकॉमबिनेंट PCSK9 एक अलग रास्ते के माध्यम से काम करने के लिए एलडीएल को कम ।
Dynasore10 Dynamins का एक छोटा सा अणु अवरोध करनेवाला है और एलडीएल के clathrin-निर्भर endocytosis को अवरुद्ध करके एलडीएल को कम कर देता है-LDLR परिसर10,३४। रिकॉमबिनेंट PCSK9, दूसरी ओर, peptidase S8 परिवार के एक सदस्य है कि LDLR को बांधता है और आवश्यक गठन परिवर्तन अवरुद्ध द्वारा आंतरिक परिसर से एलडीएल जारी करने के बाद सेल सतह के लिए अपने रिसाइकिलिंग रोकता है३५,३६ . कम सेल सतह LDLR घनत्व अंततः कोशिका द्वारा कम एलडीएल आगे बढ़ जाता है । Statins, जबकि सीधे 3-hydroxy-3-methylglutaryl-कोएंजाइम (HMG-CoA) रिडक्टेस एंजाइम और इस प्रकार कोलेस्ट्रॉल के संश्लेषण को अवरुद्ध, भी25LDLR की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए जाना जाता है,३८ वृद्धि हुई एलडीएल आगे बढ़ाने के लिए अग्रणी । इस प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता तीन नैदानिक प्रासंगिक मानव कोशिका लाइनों में एलडीएल आमद में महत्वपूर्ण कटौती का पता लगाने के द्वारा मान्य है, HK2, HepG2 और HCAECs, Dynasore और/या रिकॉमबिनेंट PCSK9 द्वारा, और HepG2 कोशिकाओं में एलडीएल में एक उल्लेखनीय वृद्धि कक्ष आकृति विज्ञान/स्वास्थ्य के लिए निगरानी के साथ चार घंटे का समय पाठ्यक्रम में Simvastatin । एक साथ ले लिया, इस विधि एक मध्यम करने के लिए उच्च प्रवाह के लिए समवर्ती औषधीय गतिविधि और लाइव कोशिकाओं में एलडीएल तेज विनियमित यौगिकों के cytotoxicity स्क्रीनिंग के लिए मंच प्रदान करता है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम विभिन्न मानव कोशिका लाइनों में एक समय पाठ्यक्रम पर वास्तविक समय एलडीएल को मापने के लिए एक नया और अधिक प्रभावी विधि के रूप में लाइव सेल इमेजिंग के उपयोग को प्रदर्शित करता है । मानव यकृत कार्सिनोमा (HepG2) कोशिकाओं को आमतौर पर अध्ययन में प्रयोग किया जाता है कोलेस्ट्रॉल कम करने वाली चिकित्सीय चिकित्सा के लिए स्क्रीनिंग21,22,23,24,25,26, ३९,४०. इसलिए, हम एलडीएल आमद अध्ययन के लिए एक जीवित सेल इमेजिंग प्रणाली की क्षमता के परीक्षण के लिए इस सेल प्रकार चुना । हमारे परिणाम से संकेत मिलता है कि HepG2 कोशिकाओं को इस नई तकनीक के साथ संगत कर रहे है और एक अवग्रह में परिणाम की तरह वक्र के लिए तांता परख की अवधि के लिए सतत एलडीएल का संकेत अंतिम समापन बिंदु के रूप में ४.३३ ज (चित्रा 2a और चित्रा 3 ).
कोलेस्ट्रोल homeostasis विभिन्न nephropathies के pathophysiology में प्रमुख भूमिका निभाता है । वास्तव में, गुर्दे के ऊतकों में कोलेस्ट्रॉल संचय गुर्दे फाइब्रोसिस क्रोनिक गुर्दे की बीमारी के लिए अग्रणी करने के लिए एक प्रमुख योगदानकर्ता है और विभिन्न nephropathies28,29,30,31में एक प्रमुख विकृति है । इसलिए, हम नेफ्रोलॉजी के क्षेत्र में उपयोग एक लोकप्रिय और विश्वसनीय सेल लाइन के रूप में मानव गुर्दे उपकला (HK2) कोशिकाओं में हमारे विधि की जांच की । हमारे डेटा भी HK2 कोशिकाओं में एलडीएल आमद को मापने के लिए लाइव सेल इमेजिंग प्रणाली की व्यवहार्यता का समर्थन किया । जैसा कि चित्रा 2बीमें दिखाया गया है, HK2 कोशिकाओं का तांता अध्ययन की अवधि (4 घंटे) में एलडीएल कोलेस्ट्रॉल रैखिक लिया ।
atherosclerosis के विकास और प्रगति में कोलेस्ट्रॉल चयापचय के महत्व के कारण३२,३३,४१, हृदय रोग का प्रमुख कारण है, जो बारी में संख्या-एक हत्यारा दुनिया भर में है ४२, हम एक atherosclerosis-प्रासंगिक कक्ष प्रकार में हमारी पद्धति को मांय करने के उद्देश्य से । हम मानव कोरोनरी धमनी Endothelial कोशिकाओं (HCAECs) का इस्तेमाल किया, के रूप में इन पहले कोशिका प्रकार में से एक एक atherosclerosis रोगी की कोरोनरी धमनी लुमेन में एक कोलेस्ट्रॉल अपमान करने के लिए उजागर हो रहे हैं । हमारे डेटा चित्रा 2सी में दिखाया गया है कि इस एलडीएल फ्लक्स विधि भी प्रभावी ढंग से HCAECs के साथ काम करता है । परिणामी ग्राफ एक अवग्रह की तरह वक्र HepG2 कोशिकाओं के समान है ।
को वैधता और स्क्रीनिंग के लिए यह सुधार एलडीएल भाटा परख की संवेदनशीलता परीक्षण यौगिकों को प्रभावित करने के लिए एलडीएल कोलेस्ट्रॉल, हम तीन नियंत्रण, एलडीएल का उपयोग कम एजेंटों Dynasore और rPCSK9, और एलडीएल आमद उत्प्रेरक Simvastatin । यहां, हम Dynasore या rPCSK9 के अनुकूलित सांद्रता के साथ उपर्युक्त सेल लाइनों (HepG2, HK2 और HCAECs) का इलाज किया तांता परख करने से पहले । हमारे परिणामों से पता चला कि सभी तीन परीक्षण सेल लाइनों एक 4 घंटे के समय पाठ्यक्रम (चित्रा 2) पर एलडीएल आमद में महत्वपूर्ण कटौती के साथ उपचार के लिए जवाब दिया । उदाहरण के लिए, अंतिम समय बिंदु के रूप में ४.३३ ज पर, ४० µ मीटर में Dynasore के साथ उपचार काफी HepG2 कोशिकाओं में एलडीएल आमद कम, HK2 कोशिकाओं और HCAECs ५३%, ६८% और ५४%, क्रमशः (पी < 0.0001; चित्रा 2 A-c और Table 2a-c). इसके अलावा, rPCSK9 पर 10 µ g/mL के कारण HK2 कोशिकाओं में एलडीएल आमद में एक चिन्हित ५५% की कमी आई (p < 0.0001; चित्रा 2 B और तालिकाबी) । इसके अलावा, हमारे निष्कर्षों से पता चला कि Simvastatin के साथ HepG2 कोशिकाओं के इलाज में एलडीएल (चित्रा 3) में एक उल्लेखनीय वृद्धि के परिणामस्वरूप, इस पद्धति की संवेदनशीलता का समर्थन करने के लिए एलडीएल आमद में महत्वपूर्ण परिवर्तन का पता लगाने । HepG2 और HCAEC कोशिकाओं में rPCSK9 के साथ उपचार के अध्ययन के रूप में rPCSK9 अच्छी तरह से प्रलेखित परिणाम के साथ एक अतिरिक्त नियंत्रण उपचार के रूप में प्रयोग किया जाता है इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं हैं, लेकिन कम मात्रा में खरीदने के लिए महंगा है । इसलिए rPCSK9 केवल HK2 कक्षों में इस प्रोटोकॉल को मांय करने के लिए उपयोग किया गया था ।
लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण, साथ कार्यात्मक और समय पर एलडीएल आमद के मापन, स्वास्थ्य और कोशिकाओं की आकृति विज्ञान की सतत निगरानी के लिए अनुमति दी । यह लाभ कुशलतापूर्वक लागू यौगिकों की संभावित cytotoxicity का पता लगा सकता है, इस विधि को एक साथ औषधीय गतिविधि और cytotoxicity की निगरानी के लिए एक आदर्श तकनीक बना रही है । आंकड़े 5-7 अंतिम समापन बिंदु पर तीन परीक्षण कक्ष लाइनों के प्रतिनिधि छवियों का वर्णन (४.३३ एच) नेट एलडीएल आमद पर उपचार के प्रभाव के लिए एक दृश्य संदर्भ के रूप में और भी परीक्षण के बाद कोशिकाओं की स्वस्थ आकृति विज्ञान से पता चलता है उपचार. हम एक अच्छी तरह से सभी छवियों के दृश्य निरीक्षण की सिफारिश करने के लिए अध्ययन की अवधि के लिए कोशिकाओं की हीथ आकृति विज्ञान आश्वासन । उदाहरण के लिए, डेटा में नहीं दिखाया गया है, जब HepG2 कोशिकाओं की छवियों ८० माइक्रोन Dynasore के साथ इलाज का निरीक्षण किया गया, हम कोशिकाओं के किनारों के रूप में सेल टुकड़ी के संकेत मनाया बंद थाली उठाने के लिए दिखाई दिया, के उच्च सांद्रता पर सेल टुकड़ी का सुझाव Dynasore । इसके अलावा, simvastatin (3-10 माइक्रोन) के उच्च सांद्रता भी statins४५की उच्च खुराक के लिए रिपोर्ट के रूप में प्रेरित apoptosis का संकेत करने के लिए परिवर्तित आकृति विज्ञान का नेतृत्व किया. इस प्रोटोकॉल के लिए 20-80 माइक्रोन पर Dynasore उपचार के एक अनुमापन प्रदर्शन किया गया था, और 0.5 में Simvastatin-10 माइक्रोन एकाग्रता, जो सेल छवियों के बाद कोशिकाओं के स्वास्थ्य का विश्लेषण और उपचार के संभावित ctotoxicity निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया विभिंन सांद्रता । परिणाम Dyansore के लिए ४० माइक्रोन और इष्टतम सांद्रता के रूप में simvastatin के लिए 1 माइक्रोन के उपयोग का सुझाव दिया ।
अंत में, हम एक सेल घनत्व अनुमापन अध्ययन करने का सुझाव अगर एक और सेल लाइन के लिए इस विधि के साथ परीक्षण के लिए अच्छी तरह से प्रति इष्टतम सेल संख्या अनुरूप परिणाम प्राप्त करने की पहचान है । हमारे सेल घनत्व अनुकूलन अध्ययन से पता चला है कि १०,००० कोशिकाओं में एक 24 अच्छी तरह से प्लेट HK2 और HCAE कोशिकाओं के लिए लगातार एलडीएल आमद परिणामों के लिए नेतृत्व में/ यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है कि इस एलडीएल तांता परख लाइव सेल इमेजिंग प्रणाली, गैर-धाराप्रवाह कोशिकाओं के एक monolayer के समान रूप से कुओं पर वितरित का उपयोग करने के लिए अंतिम सामान्यीकृत एलडीएल आमद मूल्यों में त्रुटियों को जंम दे सकता है । इस के लिए कारण है कि आमद डेटा के सामान्यीकरण के लिए, चरण वस्तु क्षेत्र कोशिका घनत्व का एक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है और सेल के झुरमुट का गठन कर रहे हैं जब इस पैरामीटर प्रतिकूल रूप से प्रभावित किया जा सकता है. हमने देखा है कि HepG2 कोशिकाओं के झुरमुट के रूप में एक प्रवृत्ति है जब घनत्व से अधिक ५,००० कोशिकाओं में वरीयता प्राप्त/ इसलिए, हम HepG2 कोशिकाओं के लिए इष्टतम घनत्व के रूप में एक 24 अच्छी तरह से थाली में प्रति अच्छी तरह से ५,००० कोशिकाओं का इस्तेमाल किया ।
सामूहिक रूप से, हमारी विधि औषधीय गतिविधि और एलडीएल प्रवाह को विनियमित यौगिकों के cytotoxicity स्क्रीनिंग के लिए एक माध्यम से उच्च प्रवाह मंच प्रदान करता है समवर्ती । इस विधि आसानी से अंय फ्लोरोसेंट-लेबल लाइगैंडों कि lysosomal डिब्बे में प्रवेश के लिए वास्तविक समय में ligand का मूल्यांकन के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । हालांकि इस प्रोटोकॉल InCucyte लाइव इमेजिंग और विश्लेषण प्रणाली के लिए विनिर्देशों प्रदान करता है, प्रोटोकॉल ऐसे Cellomics के रूप में वैकल्पिक इमेजिंग प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम लास के लिए निंनलिखित अनुदान द्वारा समर्थित किया गया: राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R56HL132209 और 1R01HL140468) और मियामी हार्ट रिसर्च इंस्टीट्यूट । KY अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन डॉक्टरेट फैलोशिप (18PRE33960070) के एक प्राप्तकर्ता है । HepG2 सेल कृपया डॉ Emmanuel थॉमस, मियामी विश्वविद्यालय के मिलर स्कूल ऑफ मेडिसिन४६,४७,४८द्वारा प्रदान की गई ।
pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
MEM | Sigma | M0325 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
24 well plate | Falcon | 353226 | |
40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |