פרוטוקול זה מספק גישה יעילה מדידת ספיגת כולסטרול LDL במחירים זרם בזמן אמת באמצעות תא חי הדמיה למערכת סוגי תאים שונים. טכניקה זו מספקת פלטפורמה למסך את פעילות פרמקולוגית של תרכובות להשפיע על זרם LDL תוך מעקב אחר עבור תא ומורפולוגיה cytotoxicity ומכאן פוטנציאליים.
התקנון של ספיגת כולסטרול LDL דרך אנדוציטוזה בתיווך LDLR הוא אזור חשוב של מחקר שונים פתולוגיות העיקריים כולל הפרעות מטבוליות, מחלות לב וכלי דם, מחלת כליות. בשלב זה אין שיטה זמין כדי להעריך את ספיגת ה-LDL תוך מעקב אחר בו זמנית לבריאות של התאים. המחקר הנוכחי מציג פרוטוקול, באמצעות תא חי הדמיה ניתוח מערכת, לרכוש מדידות טורי של LDL זרם עם ניטור הבו-זמניות עבור בריאות. טכניקה חדשנית זו נבחנה שלוש שורות תאים אנושיים (תאי אנדותל הכבד, הכליות צינורי אפיתל ולאחר כלילית העורק) במהלך הזמן ארבע שעות מספר. יתר על כן, הרגישות של טכניקה זו תאומת ידועים LDL מעכבי ספיגת, Dynasore, PCSK9 חלבון רקומביננטי, כמו גם על ידי מקדם ספיגה של LDL, סימבסטטין. יחדיו, שיטה זו מספקת פלטפורמה תפוקה בינונית-גבוהה בעת ובעונה אחת הקרנות פעילות פרמקולוגית, כמו גם הפיקוח על מורפולוגיה תאים, ומכאן cytotoxicity של תרכובות ויסות זרם ה-LDL. הניתוח יכול לשמש עם מערכות הדמיה שונים ותוכנות אנליטית.
אנדוציטוזה בתיווך LDLR קולטן של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה LDL הוא אזור חשוב של המחקר מאז במחזור רמות הכולסטרול LDL נמצאים בליבה של מחלות לב וכלי דם1, מחלת כליות2 , כמו גם מגוון רחב של דלקתיות מחלות3 והפרעות גנטיות עם מוטציות בכולסטרול תחבורה גנים4,5,6,7. לימודי בתיווך LDLR כולסטרול זרם הובילו זיהוי של כלי מחקר מרובים, כגון מעכבי Dynamin כולל את כימי Dynasore8,9,10, כמו גם מווסת LDL חלבונים כגון Proprotein Convertase סבטיליזין/Kexin הקלד 9 (PCSK9)11,12.
מסלול אנדוציטוזה LDL-LDLR מתחיל עם sequestering המתחם LDL-LDLR על פני התא לתוך בורות מצופים clathrin13. שלפוחית ואז נוצרות על-ידי invagination של קרום התא משטח הפנמת את קומפלקס LDL-LDLR וקואלות להעברה בתוך התא. כמו שלפוחית בנוי שמישראל מוקדם ומאוחר ואז endosomes, ה-pH טיפות בתוך אנדוזום מאוחר, גורם השיוך של LDL מ שלו קולטן14. בעבר, היו תלויים בשיטות של כימות של LDL זרם התווית על-ידי רדיו 125-LDL הדגירה שיתוף עם תאים, מיצוי הבאים של החלבון שאותה ניתן להתאים רדיו מתאי כימות15. ואז זה הוחלף על ידי שימוש fluorescently שכותרתה LDL חלבונים כגון DiI-LDL, ו immunostaining הבאים או חילוץ של חלבון עבור קריאות פלורסנט באמצעות ספקטרופוטומטרים או בצלחת קורא15,16. Fluorescently מתויג LDL גם שימש ב תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) לניתוח של הפנמה של LDL, תא-איגוד ה-LDL-משטח-17. בעוד ששיטות אלה לאפשר איסוף נתונים לאחר הטיפול, פיקוח על הכדאיות של התאים במהלך הטיפול אינה אפשרית.
ה-pH חומצי של אנדוזום מאוחר מאפשר השימוש של בדיקה pH מופעל LDL פלורסנט כגון pHrodo LDL האדום הזה שזוהר לאחר הפנמה18,19. מאפיין זה מאפשר לקורס זמן רציף של LDL הערכת ספיגת בתאים חיים. לכן, פרוטוקול זה מנצל pHrodo אדום-LDL הדמיה זריחה בניתוח תא חי כדי באופן סדרתי מדד ה-LDL ספיגת עם ניטור בו-זמניות לבריאות תא. התוצאות מצביעות על האמינות של טכניקה חדשנית זו, כפי שנבדקו במהלך הזמן ארבע שעות מספר שלוש שורות תאים אנושיים שונים, תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HepG2), תאים אנושיים (HK2) כליות אפיתל, כלילית עורקי אנדותל תאים אנושיים (HCAEC ). שורות תאים אלה יש משמעות קלינית ל- LDL סיווג20,21,22,23,24,25,26,27 , כליות מחלת28,29,30,31, מחלות לב32,33, בהתאמה. בנוסף לניטור זרם LDL, פרוטוקול זה משלבת טיפול עם שני מעכבי ספיגת ידועים של LDL, מימה Dynasore, חלבון רקומביננטי PCSK9, כמו גם של משרן סטטינים של הביטוי LDLR ו LDL ספיגת, סימבסטטין. Dynasore רקומביננטי PCSK9 כל עובד דרך מסלולים שונים כדי להפחית את ספיגת ה-LDL.
Dynasore מפחיתה את ספיגת ה-LDL על ידי חסימת clathrin תלוית אנדוציטוזה של LDL-LDLR מורכבים10,34וזה מעכב מולקולה קטנה של Dynamins10 . PCSK9 רקומביננטי, מצד שני, הוא חבר של peptidase המשפחה S8 נקשר LDLR, מעכב את מיחזור השטח תא לאחר שחרור ה-LDL מהמתחם למביטה על ידי חסימת שינויים נדרשים הסתגלותי35,36 . צפיפות LDLR פני שטח התא ירד בסופו של דבר שמוביל מופחתת ספיגת LDL על ידי התא. סטטינים, תוך ישירות חסימת האנזים רדוקטאז (HMG-CoA) 3-הידרוקסי-3-methylglutaryl-קואנזים ובכך ביוסינטזה כולסטרול, גם ידועים upregulate הביטוי של25,LDLR38 שמוביל מוגברת ספיגת LDL. הרגישות של פרוטוקול זה מאומת על ידי גילוי הפחתה משמעותית ב LDL זרם שורות שלושה תאים אנושיים הרלוונטית קלינית, HK2, HepG2, HCAECs, Dynasore ו/או רקומביננטי PCSK9, ו עלייה ניכרת LDL ספיגת בתאים HepG2 על ידי סימבסטטין מסלול זמן של 4 שעות עם ניטור לבריאות/תא מורפולוגיה. יחדיו, שיטה זו מספקת פלטפורמה תפוקה בינונית-גבוהה לסינון במקביל את פעילות פרמקולוגית ואת cytotoxicity של תרכובות מווסת את ספיגת ה-LDL ב תאים חיים.
בפרוטוקול הנוכחי, נדגים את הניצול של תא חי הדמיה כשיטה חדש ויעיל יותר למדידת זמן אמת LDL ספיגת מעל הזמן קורס שורות תאים אנושיים שונים. תאי קרצינומה של הכבד האנושי (HepG2) משמשים במחקרים הקרנת עבור הורדת כולסטרול הרפוי21,22,23,24,25,26, 39,40. לכן, בחרנו את סוג התא לבדיקת היכולת של מערכת הדמיה של תא חי ללימודי זרם ה-LDL. התוצאות שלנו מציינים כי תאים HepG2 תואמים זו טכניקה חדשה והתוצאה בעקומה סיגמואיד דמוי המציין ספיגת LDL רציף משך זמן וזמינותו זרם עד 4.33 h בתור נקודת הקצה הסופי (איור 2A ו- איור 3 ).
כולסטרול הומאוסטזיס ממלא תפקיד מרכזי הפתופיזיולוגיה של nephropathies שונים. אכן, הצטברות כולסטרול ברקמת הכליה הוא תורם מרכזי סיסטיק כליות למחלות כליות כרונית והוא פתולוגיה העיקריים ב-30,29,28,nephropathies שונים31. ומכאן, בדקנו את השיטה שלנו בתאי אדם כליות אפיתל (HK2) כקו תא פופולרי ואמין מנוצל בתחום נפרולוגיה. הנתונים שלנו נתמך גם את הכדאיות של מערכת ההדמייה תא חי כדי למדוד זרם LDL בתאים HK2. כפי שמוצג באיור 2B, תאים HK2 לקח את ה-LDL כולסטרול באופן ליניארי לאורך משך המחקר זרם (4 שעות).
בשל חשיבות המטבוליזם כולסטרול פיתוח, ההתקדמות של טרשת עורקים32,33,41, הגורם המוביל של מחלות לב וכלי דם, אשר בתורו הרוצח מספר אחת בעולם 42, כיוונו כדי לאמת את השיטה שלנו בסוג התא טרשת עורקים-רלוונטי. השתמשנו כלילית עורקי אנדותל תאים אנושיים (HCAECs), שכן הן אחד מסוגי התא הראשון להיחשף עלבון כולסטרול בלומן עורקים של חולים טרשת עורקים. הנתונים שלנו שמוצג באיור 2C מציין כי שיטה זו זרם LDL גם עובד ביעילות עם HCAECs. זהו גרף תוצאות עקומה דמויית סיגמואיד דומה לזה של תאים HepG2.
כדי לבדוק את תוקפו ואת הרגישות של זה וזמינותו זרם LDL משופר לסינון תרכובות להשפיע על ספיגת LDL-כולסטרול, השתמשנו שלושה פקדים, סוכנים ספיגת להורדת LDL Dynasore ו rPCSK9 ו LDL זרם activator סימבסטטין. . הנה, התייחסנו לעיל הזכיר שורות תאים (HepG2, HK2 ו- HCAECs) עם ריכוזים מיטביים של Dynasore או rPCSK9 לפני וזמינותו זרם. התוצאות שלנו הראה כי כל שלושה קווי בדוקות התא הגיב הטיפולים עם הפחתות משמעותיות LDL זרם מעל 4 שעות קורס (איור 2). למשל, ב- h 4.33 כנקודת בפעם האחרונה, טיפול עם Dynasore-40 µM הקטינה באופן משמעותי זרם ה-LDL HepG2 תאים, התאים HK2, HCAECs על ידי 53%, 68% ו- 54%, בהתאמה (p < 0.0001; איור 2 A-C ו לטבלה 2A-C). בנוסף, rPCSK9-10 µg/mL גרם הפחתה 55% מסומן ב- LDL זרם בתאים HK2 (p < 0.0001; איור 2 B ו לטבלה 2B). יתרה מזאת, הממצאים שלנו הראה כי טיפול HepG2 תאים עם סימבסטטין הביא עלייה ניכרת ספיגת LDL (איור 3), המשנה את הרגישות של שיטה זו לזהות שינויים משמעותיים זרם ה-LDL. מחקרים של הטיפול עם rPCSK9 בתאים HepG2 ו- HCAEC לא נכללות פרוטוקול זה כמו rPCSK9 משמש כטיפול בקרה נוספים עם תוצאות מתועדת היטב, אבל הוא יקר לקנות בכמויות קטנות. לכן rPCSK9 שימשה רק כדי לאמת את פרוטוקול זה בתאים HK2.
חיים תא הדמיה ניתוח, יחד עם המידה פונקציונלי ומתוזמן של זרם LDL, המותר עבור ניטור רציף של בריאות מורפולוגיה של התאים. יתרון זה יכול לזהות ביעילות cytotoxicity הפוטנציאליים של תרכובות יישומית, הופך שיטה זו טכניקה אידיאלית עבור בו-זמנית ניטור פעילות פרמקולוגית של cytotoxicity. דמויות 5-7 להמחיש להחליפן בתמונות של שלושת הקווים תא שנבדקו על נקודת הקצה הסופי (4.33 ח) כהפניה חזותית עבור האפקט של הטיפולים ב- net זרם LDL ו גם מראה בריא המורפולוגיה של תאי בעקבות של נבדק טיפולים. אנו ממליצים על בדיקה ויזואלית של כל תמונות מכל קידוח כדי להבטיח heathy המורפולוגיה של תאי לתקופת המחקר. לדוגמה, בנתונים לא מוצג, כאשר תמונות של HepG2 תאים שטופלו 80 μM Dynasore נבדקו, נצפו סימנים של ניתוק התא קצות התאים הופיעה להיות הרמת רלוונטי, רומז ניתוק התא בריכוזים גבוהים של Dynasore. יתר על כן, ריכוזים גבוהים של סימבסטטין (3-10 μM) גם הובילה מורפולוגיה שונה המציינת המושרה אפופטוזיס כפי שדווח על מינונים גבוהים של סטטינים45. פרוטוקול זה שימש לביצוע טיטור הטיפול Dynasore של 20-80 μM, סימבסטטין ב 0.5-10 μM ריכוז, בעקבות ששימשו התמונות תא לניתוח הבריאות של התאים ולקביעת ctotoxicity הפוטנציאליים של הטיפולים- ריכוזים שונים. תוצאות הציע את השימוש 40 μM עבור Dyansore ו- 1 μM של סימבסטטין כמו ריכוז אופטימלי.
לבסוף, אנו ממליצים לבצע מחקר טיטור צפיפות תא אם קו תא אחר להיבדק בשיטה זו כדי לזהות את מספר התא האופטימלי לכל טוב כדי להשיג תוצאות עקביות. מחקר אופטימיזציה צפיפות שלנו סלולרי הראה כי 10,000 תאים/היטב לתוך צלחת 24-ובכן להוביל לתוצאות זרם LDL עקבית עבור תאים HK2 ו- HCAE. חשוב לציין כי עבור זה LDL זרם assay באמצעות תא חי מערכת הדמיה, טפט של תאים שאינם confluent מופץ באופן שווה על הבארות רצוי כמו גושים של תאים עשוי להצמיח שגיאות הערכים הסופיים LDL מנורמל זרם. הסיבה לכך היא כי על נירמול הנתונים זרם, שטח אובייקט בשלב זה משמש כאמצעי של צפיפות התאים, פרמטר זה יושפעו לרעה כאשר התא גושים נוצרות. הבחנו כי תאים HepG2 יש נטייה גושים טופס כאשר נזרע על צפיפות גבוהה יותר 5,000 תאים/טוב גרימת התוצאות זרם לא עקבי; לכן, השתמשנו תאים 5,000 לכל טוב לתוך צלחת 24-טוב כמו צפיפות מיטבית עבור תאים HepG2.
באופן קולקטיבי, השיטה שלנו מספק פלטפורמה תפוקה בינונית-גבוהה לסינון את פעילות פרמקולוגית ואת cytotoxicity של תרכובות ויסות זרם LDL בו-זמנית. בשיטה זו ניתן להתאים בקלות לשימוש עם אחרים ליגנדים שכותרתו fluorescently מזין תא lysosomal כדי להעריך את ספיגת ליגנד בזמן אמת. פרוטוקול זה מציע מפרט עבור InCucyte חיים הדמיה, ניתוח מערכת, הפרוטוקול ניתן להתאים למערכות הדמיה חלופיים, כגון Cellomics.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים כדי בלאס: המכון הלאומי לבריאות (R56HL132209 ו- 1R01HL140468), מכון המחקר של הלב מיאמי. KY היא נמען האחווה האמריקאי הלב האגודה Predoctoral (18PRE33960070). תאים HepG2 נמסרו באדיבות מאת ד ר עמנואל תומאס, אוניברסיטת מיאמי-מילר הספר לרפואה46,47,48.
pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
MEM | Sigma | M0325 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
24 well plate | Falcon | 353226 | |
40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |