Denne protokol giver en effektiv tilgang til måling af LDL kolesterol optagelse med realtid tilstrømning priser ved hjælp af en levende celle imaging system i forskellige celletyper. Denne teknik giver en platform til at screene den farmakologiske aktivitet af forbindelser der påvirker LDL tilstrømning under kontrol for celle morfologi og dermed potentielle cytotoksicitet.
Regulering af LDL kolesterol optagelse gennem LDLR-medieret endocytose er et vigtigt område af undersøgelse i forskellige vigtige patologier herunder stofskiftesygdom, hjerte-kar-sygdom og nyresygdom. I øjeblikket er der ingen tilgængelig metode til at vurdere LDL optagelse mens samtidig overvågning af sundheden for cellerne. Den nuværende undersøgelse præsenterer en protokol, ved hjælp af en levende celle imaging analysesystem, for at erhverve serielle målinger af LDL tilstrømning med samtidige overvågning for celle sundhed. Denne nye teknik er testet i tre menneskelige cellelinjer (hepatisk, renal tubulær epitel, og koronar arterie endotelceller) over en fire-timers kursus. Derudover er følsomheden i denne teknik valideret med velkendte LDL uptake hæmmere, Dynasore og rekombinante PCSK9 protein, samt af en LDL optagelse promotor, Simvastatin. Tilsammen, giver denne metode en medium til høj overførselshastighed platform for samtidig screening farmakologiske aktivitet samt overvågning af celle morfologi, dermed cytotoksicitet af forbindelser regulering LDL tilstrømning. Analysen kan anvendes med forskellige Billeddannende systemer og analytisk software.
Low Density Lipoprotein Receptor LDLR-medieret LDL endocytose er et vigtigt område af undersøgelse, da cirkulerende LDL kolesterolniveauer er kernen i hjerte-kar-sygdom1, nyre sygdom2 samt en bred vifte af inflammatoriske sygdomme3 og genetiske sygdomme med mutationer i kolesterol transport gener4,5,6,7. Undersøgelser i LDLR-medieret kolesterol tilstrømning har ført til identifikation af flere forskningsværktøjer, såsom Dynamin-hæmmere, herunder den kemiske Dynasore8,9,10, samt regulering af LDL proteiner som Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9 (PCSK9)11,12.
LDL-LDLR endocytose pathway begynder med binding af LDL-LDLR kompleks på cellens overflade i clathrin-belagt pitten13. Vesikler er så dannet af invagination af overflade cellemembranen internalisere LDL-LDLR komplekset i vacuoles for transport inde i cellen. Som den dannede vesikel modnes i begyndelsen og derefter sent endosomes, falder pH inde den sene endosome, forårsager afstandtagen af LDL fra dens receptor14. I fortiden afhang metoder til kvantificering af LDL tilstrømning radio-mærket 125-LDL Co inkubering med celler og efterfølgende udvinding af den radioaktivt mærkede protein fra celler for kvantificering15. Dette blev derefter erstattet af brugen af fluorescently mærket LDL proteiner som DiI-LDL, og efterfølgende immunfarvning eller udvinding af protein for fluorescerende aflæsninger ved hjælp af et spektrofotometer eller plade læser15,16. Fluorescently mærket er LDL også blevet brugt i fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) til analysen af internaliseringen af LDL og celle overflade LDL bindende17. Mens disse metoder giver mulighed for indsamling af data efter behandling, er overvågning levedygtigheden af cellerne under behandling ikke muligt.
Sure pH-værdi i de sene endosome tillader brug af en pH-aktiveret fluorescerende LDL sonde som pHrodo røde LDL, der fluorescerer efter internalisering18,19. Denne egenskab giver mulighed for en kontinuerlig tidsforløb af LDL optagelse vurdering i levende celler. Derfor, denne protokol udnytter pHrodo rød-LDL fluorescens imaging i en levende celle analyse seriefremstillede foranstaltning LDL optagelsen med samtidige overvågning for celle sundhed. Resultaterne indikerer pålideligheden af denne roman teknik som testet over en fire-timers kursus i tre forskellige menneskelige cellelinjer, menneskelige hepatisk karcinom (HepG2) celler, humane renal epitel (HK2) celler og menneskelige koronar arteriel endothelial celler (HCAEC ). Disse cellelinjer er klinisk signifikant til LDL clearance20,21,22,23,24,25,26,27 , nyre sygdom28,29,30,31, og hjertesygdomme32,33, henholdsvis. Ud over overvågning af LDL tilstrømningen, omfatter denne protokol behandling med to velkendte LDL uptake hæmmere, Dynasore hydrat og rekombinante PCSK9 protein samt et statin inducer af LDLR udtryk og LDL optagelse, simvastatin. Dynasore og rekombinante PCSK9 hver arbejde gennem forskellige veje til at reducere LDL optagelse.
Dynasore er et lille molekyle hæmmer af Dynamins10 og reducerer LDL optagelse ved at blokere clathrin-afhængige endocytose af LDL-LDLR komplekse10,34. Rekombinante PCSK9, på den anden side er medlem af peptidase S8 familien, der binder sig til LDLR og hæmmer dets genanvendelse til cellens overflade efter at slippe LDL fra internaliseret komplekset ved at blokere kræves konformationelle ændringer35,36 . Nedsat celle overflade LDLR tæthed fører i sidste ende til lavere LDL optagelse af cellen. Statiner, er mens direkte blokerer for 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym (HMG-CoA) reduktase enzym- og dermed kolesterol biosyntesen, også kendt for at upregulate udtryk for LDLR25,38 fører til øget LDL optagelse. Følsomheden af denne protokol er valideret ved at opdage væsentlige reduktioner i LDL tilstrømning i tre klinisk relevante menneskelige cellelinjer, HK2, HepG2 og HCAECs, af Dynasore og/eller rekombinante PCSK9, og en markant stigning i LDL optagelse i HepG2 celler ved Simvastatin i en fire-timers kursus med overvågning for celle morfologi/sundhed. Tilsammen, giver denne metode en medium til høj overførselshastighed platform for samtidigt screening farmakologiske aktivitet og cytotoksicitet af forbindelser regulering LDL optagelse i levende celler.
I den nuværende protokol viser vi udnyttelsen af levende celle imaging som en ny og mere effektiv metode til at måle realtid LDL optagelse over et tidsforløb i forskellige menneskelige cellelinjer. Menneskelige hepatisk karcinom (HepG2) celler er almindeligt anvendt i undersøgelser screening for kolesterol-sænkende therapeutics21,22,23,24,25,26, 39,40. Derfor valgte vi denne celletype til at teste evnen til en levende celle billedbehandlingssystem for LDL tilstrømning undersøgelser. Vores resultater viser, at HepG2 celler er forenelige med denne nye teknik og resultat i en sigmoid-lignende kurve der angiver kontinuerlig LDL optagelse for varigheden af tilstrømning assay indtil 4,33 Hansen som den endelige slutpunkt (figur 2A og figur 3 ).
Kolesterol homøostase spiller en stor rolle i Patofysiologi af forskellige nephropathies. Kolesterol ophobning i nyre væv er en stor bidragyder til renal fibrose fører til kronisk nyresygdom og er en større patologi i forskellige nephropathies28,29,30,31. Derfor undersøgte vi vores metode i menneskelige renal (HK2) epitelceller som en populær og pålidelig cellelinie udnyttet inden for nefrologi. Vores data understøttes også muligheden for den levende celle imaging system til at måle LDL tilstrømning i HK2 celler. Som vist i figur 2B, tog HK2 celler LDL kolesterol lineært i hele varigheden af tilstrømning undersøgelse (4 timer).
På grund af betydningen af kolesterol metabolisme i udvikling og progression af aterosklerose32,33,41, den hyppigste årsag til hjerte-kar-sygdom, som igen er nummer et morderen på verdensplan 42, vi havde til formål at validere vores metode i en åreforkalkning-relevante celletype. Vi brugte humane koronar arteriel Endothelial celler (HCAECs), da disse er en af de første celletyper til at blive udsat for en fornærmelse af kolesterol i kranspulsåren lumen af en åreforkalkning patienten. Vores data, vist i figur 2C angiver, at denne LDL tilstrømning metode også fungerer effektivt med HCAECs. Den deraf følgende graf er en sigmoid-lignende kurve ligner HepG2 celler.
For at teste gyldigheden og følsomhed på denne forbedrede LDL tilstrømning assay for screening forbindelser påvirker LDL-kolesterol optagelse, brugte vi tre kontrolelementer, LDL optagelse-sænkende stoffer Dynasore og rPCSK9 og LDL tilstrømning aktivator Simvastatin. Her, vi behandlede den ovenfor nævnte cellelinjer (HepG2, HK2 og HCAECs) med optimeret koncentrationer af Dynasore eller rPCSK9 før tilstrømning assay. Vores resultater viste, at alle tre testede cellelinjer reageret på behandlingerne med betydelige reduktioner i LDL tilstrømning over en 4-timers kursus (figur 2). Eksempelvis på 4,33 Hansen som den endelige tidspunkt, behandling med Dynasore på 40 µM betydeligt reduceret LDL tilstrømning i HepG2 celler, HK2 celler og HCAECs 53%, 68% og 54%, henholdsvis (p < 0,0001; Figur 2 A-C og Tabel 2A-C). Derudover rPCSK9 på 10 µg/mL forårsaget en markant 55% reduktion i LDL tilstrømning i HK2 celler (p < 0,0001; Figur 2 B og tabel 2B). Vores resultater viste desuden, at behandle HepG2 celler med Simvastatin resulteret i en markant stigning i LDL optagelse (figur 3), støtte følsomheden af denne metode til at påvise betydelige ændringer i LDL tilstrømning. Undersøgelser af behandling med rPCSK9 i HepG2 og HCAEC celler er ikke inkluderet i denne protokol, som rPCSK9 er brugt som en ekstra kontrol behandling med veldokumenterede resultater, men er dyrt at købe i små mængder. RPCSK9 var derfor kun bruges til at validere denne protokol i HK2 celler.
Live celle imaging analyse, sammen med de funktionelle og rettidig måling af LDL tilstrømning, mulighed for løbende overvågning af sundhed og morfologi af celler. Denne fordel kan effektivt opdage potentielle cytotoksicitet af de anvendte stoffer, gør denne metode en ideel teknik til samtidig overvågning af farmakologiske aktivitet og cytotoksicitet. Tallene 5-7 illustrere repræsentative billeder af de tre testede cellelinjer på den endelige slutpunkt (4,33 h) som en visuel reference for effekten af behandlinger på netto LDL tilstrømning og viser også de sunde morfologi af celler efter den testede behandlinger. Vi anbefaler visuel inspektion af alle billederne fra hver brønd til at forsikre heathy morfologi af cellerne for varigheden af undersøgelsen. For eksempel i data, der ikke vises, da billeder af HepG2 celler behandlet med 80 μM Dynasore blev inspiceret, vi observeret tegn på celle udstationering som kanterne af cellerne syntes at være løfte fra pladen, tyder på celle detachement ved højere koncentrationer af Dynasore. Derudover induceret høje koncentrationer af simvastatin (3-10 μM) også ført til ændrede morfologi angiver apoptose som rapporteret for høje doser af statiner45. Denne protokol blev brugt til at udføre en titrering af Dynasore behandling på 20-80 μM og Simvastatin på 0,5-10 μM koncentration, hvorefter celle billeder blev brugt til at analysere sundheden for cellerne og bestemme potentielle ctotoxicity af behandlinger på forskellige koncentrationer. Resultater foreslog at benytte 40 μm for Dyansore og 1 μM for simvastatin som optimal koncentrationer.
Endelig foreslår vi, at udføre en celle tæthed titrering undersøgelse, hvis en anden cellelinje er at blive testet med denne metode for at identificere de optimale celle nummer pr. brønd for at få ensartede resultater. Vores celle tæthed optimering undersøgelse viste, at 10.000 celler/brønd i en 24-godt plade føre til konsekvent LDL tilstrømning udfald for HK2 og HCAE celler. Det er vigtigt at bemærke, for denne LDL tilstrømning analyse ved hjælp af levende celle imaging system, en éncellelag af ikke-sammenflydende celler fordelt jævnt på brøndene er ønskeligt, som klumper af celler kan give anledning til fejl i de endelige normaliserede LDL tilstrømning værdier. Grunden til dette er, at for en normalisering af tilstrømning data, fase objekt området bruges som en målestok for celle tæthed og denne parameter kan påvirkes negativt, når celle klumper er dannet. Vi observerede, at HepG2 celler har en tendens til form klumper når seedede ved tætheder højere end 5.000 celler/brønd forårsager inkonsekvent tilstrømning resultater; Derfor, vi brugte 5.000 celler pr. brønd i en 24-godt plade som optimal tæthed for HepG2 celler.
Kollektivt, giver vores metode en medium til høj overførselshastighed platform for screening farmakologiske aktivitet og cytotoksicitet af forbindelser regulering LDL tilstrømning samtidigt. Denne metode kan tilpasses let til brug med andre fluorescently mærket ligander, som angiver den lysosomale rum for at evaluere ligand optagelse i realtid. Mens denne protokol tilbyder specifikationer for InCucyte live billedbehandling og analysesystem, protokollen kan tilpasses for alternative Billeddannende systemer som Cellomics.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af de følgende tilskud til LAS: National Institute of Health (R56HL132209 og 1R01HL140468) og Miami hjerte Research Institute. KY er modtager af American Heart Association Predoctoral Fellowship (18PRE33960070). HepG2 celler blev venligst leveret af Dr. Emmanuel Thomas, universitetet i Miami Miller School Medicine46,47,48.
pHrodo Red-LDL | ThermoFisher Scientific | L34356 | |
HepG2 cells | E. Thomas Lab, U. Miami | HB-8065 | |
MEM | Sigma | M0325 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | |
L-Glutamine 200mM solution | Sigma | G7513 | |
FBS | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
HK2 cells | ATCC | CRL-2190 | |
Keratinocyte SFM media kit | Gibco | 17005-042 | |
Primary Coronary Artery Endothelial Cells | ATCC | PCS-100-020 | |
Vascular Cell Basal Medium | ATCC | PCS-100-030 | |
Endothelial Cell Growth Kit-VEGF | ATCC | PCS-100-041 | |
Human Lipoprotein Deficient Serum | Millipore | LP4 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Gemini Bio-Products | 400-150 | |
Trypsin Neutralizing Solution | ATCC | PCS-999-004 | |
24 well plate | Falcon | 353226 | |
40 μM mesh cell strainer | VWR | 10199-654 | |
15 mL conical tubes | VWR | 89039-666 | |
50 mL conical tubes | VWR | 89039-658 | |
Trypan Blue Staining (0.4%) | Life Technologies | T10282 | |
Counting Slides | Bio-Rad | 145-0011 | |
Incucyte Zoom | Sartorius | Zoom | Imaging and analysis platform |
Dynasore Hydrate | Sigma | D7693 | |
PCSK9 Recombinant Protein | Cayman Chemicals | 20631 |