선물이 단일 레이블이 없는 단백질의 실시간 광학 탐지에 대 한 프로토콜으로 그들은 살아있는 세포에서 분 비 됩니다. 이 간섭 산란 (iSCAT) 현미경 검사 법, 다양 한 다른 생물 학적 시스템 및 구성에 적용 될 수 있는 기반으로 합니다.
간섭 산란 (iSCAT) 현미경 검사 법, 실시간으로 개별 살아있는 세포에서 분 비 하는 단일 레이블 없는 단백질을 검출 하는 방법 설명 합니다. 이 프로토콜에서 우리는 기본적인 단계를 iSCAT 현미경을 실현 하 고 추가적인 이미징 채널 모니터링 연구에서 세포의 생존 능력을 보완을 커버. 이것 다음, 사용 방법을 단일 단백질의 실시간 탐지에 대 한 그들은 우리는 불멸 하 게 B-세포 선 (Laz388)으로 설명 하는 살아있는 세포에서 분 비 합니다. 현미경 및 샘플의 준비 뿐만 아니라 기록 된 데이터의 분석에 관한 필요한 단계는 설명 합니다. 비디오 프로토콜 그 iSCAT 현미경 검사 법은 단일 분자 수준에서 분 비 공부를 간단한 방법을 제공 하는 방법을 보여 줍니다.
분 비 단백질은 다양 한 생리 적 프로세스1에 중요 한 역할을 한다. 이 때문에, 그들은 정기적으로 집단 앙상블 (proteomics) 또는 개별 엔터티2,3공부는. Proteomics는 전통적으로 예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA), cytometry, 또는 질량 분석4,5, 특정 생물 학적 시스템에 존재 하는 단백질의 전체 집합을 조사 6. 단일 단백질, 다른 한편으로, 일반적으로 감지 다양 한 형광7,8, 염료9,10또는 저온 전자11 을 기반으로 하는 기법을 사용 하 여 microscopies입니다. 이러한 모든 기술 복잡 한 악기, 라벨, 또는 둘 다 사용 하 고 부족 한 역학 정보로만 연구 시스템에 대 한 장기적인 정보 제공.
여기 iSCAT12,13 현미경 감각 개별 분 비 단백질을 사용 하 여 초 시간적 해상도14. 중요 한 것은, 기술은 모든 단백질12,14본질적인 약한 흩어져 신호를 감지합니다. 작은 bioparticle 없앤다는 빛 양을 그것의 polarizability와 함께 확장 됩니다. 가정 하는 단백질의 형태를 다른 한 효과적인 분산 영역14,15,16, 그리고 그에 의해 접근 수 있습니다. 단백질 매우 비슷한 굴절율, 측정된 된 신호는 직접 수 단백질의 분자량 (MW)에 연결합니다. ISCAT 대비 대 분자량의 측정 기준에 의해 경험적 교정 다양 한 크기의 단백질을 구별할 수 있습니다. iSCAT 실험 쉽게 관심14 의 어떤 단백질의 특정 검색에 대 한 있도록 형광 또는 비 산 레이블 뿐만 아니라 형광 현미경 검사 법17,18, immunosorbent 시 약, 보충 될 수 있다 , 17 , 19.
원칙적으로, iSCAT 보조 참조 파와 간섭 혼합을 통해 단백질의 약한 흩어져 빛을 증폭 하 여 작동 합니다. 검색 된 강도 ()는 iSCAT에서 현미경에 의해 설명
어디 사건 강도 참조 웨이브의 기여에 대 한 계수는 연구, 나노-개체의 산란 강도 의미와 는 흩어져 사이 상전이 고 참조 파도14. 두 전송 또는 다시 반영 사건 빛 일반적으로 각각의 경우에 기준 파로 사용 투과율 또는 반사율 샘플 챔버의 각각 차지. 기간 단백질의 비 산 크로스 섹션에 비례 하 고 크로스 기간에 비해 무시 될 수 있습니다. 따라서, 설정 완전 한 파괴 간섭에 대 한 감지 된 빛에 의해 주어진 다 어디 참조 강도 및 간섭 강도.
iSCAT 현미경 단일 분자 수준에 생물학 과정을 공부 하는 우수한 방법을 제공 합니다. 예를 들어, 우리는 Laz388 세포를 조사-엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 변형 B 림프 구 세포 선20,21 -로 그들은 IgG 항 체16같은 단백질을 분 비. 그러나, 메서드는 일반 이며 다양 한 다른 생물 학적 시스템에 적용할 수 있습니다. iSCAT은 기본적으로 특정 어떤 단백질을 검출할 수 있다 또는 나노 또는 특정 또는 다중화 검출에 대 한 일반적인 표면 기능화 방법으로 확장할 수 있습니다. 그것의 간명 및 형광 현미경 검사 법, 같은 다른 광학 기술로 결합 될 수 확인 iSCAT 유용한 무료 도구 세포 생물학.
유용한 iSCAT 데이터를 취득 하는 가장 중요 한 측면 중 하나는 coverslip 표면에 그리고, 또한, 정확한 초점 위치를 찾을 수 오랜 시간 동안이 자리를 잡아. 이렇게 하려면 실패 확대 PSFs, 약한 iSCAT 신호 및 드리프트 관련 아티팩트 역학 분석에서 발생 합니다. 그것은 밝혀 깨끗 하 고 맨 손으로 coverslip에 초점 비행기를 찾는 표면 하지 쉬운 작업 표면 특징은 큰 참조 빔 배경으로 ( 그림 4 d참조).
원시 iSCAT 이미지는 종종 여기 소스에 파면 불순물에서 발생 하 고 올바른 이미징 비행기를 찾을 수의 능력을 방해할 수 배경 신호에 의해 왜곡 됩니다. 활성 wavefront 빼기가이 문제를 회피 하 고 이후에 측정16동안 iSCAT 초점을 모니터링 하는 유용한 방법입니다. 이 한 가지 방법은 공간 샘플 변조입니다. 간단히, 함수 발생기 적용된 주파수 (290 nm 진폭)에서 공간 샘플 변조에 따른 압 전 단계의 외부 제어 포트를 50 Hz의 구형 파를 적용 합니다. 동기 카메라 인수 같은 소스에서 그리고, 자물쇠 원리, 파면 보상 이미지14,16결과 통해 결합 될 때 트리거됩니다. 결과 이미지는 일반적으로 표면 거칠기 coverslip (그림 4e)의 보여줍니다. 청소 후 유리에 남아 있는 작은 기능 초점에 현미경을가지고 사용할 수 있습니다. 프레임 속도, 노출 시간, 또는 하드웨어가 활성 배경 빼기 단계에 사용 된 매개 변수를 변경할 수 있습니다.
위에서 설명 했 듯이, iSCAT 설치 (1.2.1 단계.)에서 높은-품질 빔 스플리터를 사용 하 여 것이 좋습니다, 대충 같은 유물을 이미징 또는 얇은 평면 빔 스플리터에서 발생 하는 간섭 영향을 이미지 하 고 측정을 방해. 그림 7 높은-품질과 낮은-품질 빔 스플리터 사이 비교를 보여 줍니다. 두 원시 iSCAT 이미지 일부 잔여 입자를 포함 하는 coverslip에 동일한 영역을 표시 합니다. 동일한 iSCAT 설치는 두 이미지를 캡처하는 데 사용 되었다, 빔 스플리터만 교환 했다. 그림 7a 는 두꺼운 (5 mm), 사용 하 여 카메라에 형성 하는 이미지를 보여줍니다 아칸소 코팅, 및 근육 빔 스플리터. 근육 디자인 빔 스플리터의 뒤 표면에서 반사 된 빔 앞 표면에서 발생 하는 반사 방지 평행 이며 목표 입력 하지. 아니 간섭 유물 발생합니다. 그림 7b 샘플에 보기의 동일한 필드를 표시 하지만이 이번 얇은 (1 mm) 평면 빔 스플리터가 사용 되었다. 빔 스플리터의 정면 그리고 뒤 표면에서 두 반사 병렬 하 고 카메라에 전파. 간섭 유물 명확 하 게 볼 수 있습니다.
그림 7: 비교 iSCAT 이미지의 고품질 및 낮은 빔 스플리터와 생산. 5 m m 두께, 아칸소 코팅, 및 근육 빔 스플리터의 사용 (a) 결과 원시 iSCAT 이미지. (b) 1 m m 두꺼운 평면 빔 스플리터를 사용 하 여 동일한 영역의 결과 원시 iSCAT 이미지. 두 빔 스플리터는 동일한 분할 비율 (50% 반영, 50% 전송). 프레넬 반사에서 발생 하는 간섭 유물 1 m m 두꺼운 평면 빔 스플리터와 이미지에 명확 하 게 관찰 된다. 스케일 바: 2 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 프로토콜에서 우리 iSCAT에 대 한 넓은 필드 조명 체계를 설명 하는으로 그것은 빠르고, 실현 하기 쉬운 넓은 지역14이상 병렬 감지에 대 한 허용 합니다. 또 다른 일반적인 접근 acousto 광학 deflectors (AODs)를 사용 하 여 샘플12,17걸쳐 confocal 빔 스캔입니다. 이 이렇게 높은-품질 wavefronts의 필요성을 피할 수 있지만 기존의 넓은 필드 영상 보다 더 실험적으로 복잡. 또한, confocal 조명의 속도 AODs에 의해 제한 됩니다. 원하는 실험 매개 변수에 따라 어느 confocal 또는 넓은 필드 조명 계획, 원칙적, 활용할 수 있습니다 살아있는 세포에서 분 비 한 단백질을 검출 하기 위하여.
프로토콜을 통해 설명 했 듯이, 현미경의 샘플 단계에서 측면 기계적인 동요를 최소화 하기 위해 필수적입니다. 샘플의 위치에도 나노미터 편차 변화 연속 카메라 프레임에 리드 하 고 차동 이미지에 상당한 외부 잡음을 유발 수 있습니다. 따라서 기계적으로 안정 된 현미경 단계와 감쇠 광학 테이블 (단계 1.1.1.)를 사용 하 고 실험 (3.5 단계.) 동안 광 커튼 또는 패널 설치를 커버 것 좋습니다.
활성 포커스 안정화 체계는 또한 장기 측정에 대 한 간주 될 수 있습니다. 이 방법에서는, 두 번째 레이저 총 내부 반사 (사격) 배열, 현미경에 통합 이며 이후 사분면 광다이오드에 몇 군데. 시스템의 초점 변경 사분면 다이오드, 압 전 단계26의 z 축을 제어 하는 적극적인 피드백 루프에 사용할 수 있습니다에 자리 사격 레이저의 수평 변위로 번역. 장기 수직 드리프트 효과 따라서 제거 됩니다.
몇 가지 수정 및 확장 주소 특정 실험적인 요구 제시 기술에 적용할 수 있습니다. 상업적인 현미경 단계 incubators 사용할 수 있습니다 예를 들어 있는 셀의 장기 이미징 iSCAT 현미경에 통합 될 쉽게 수. 다른 기술을 iSCAT 이미징와 같은 보완을 구현할 수도 있습니다 confocal 또는 사격 형광 microscopies17. 그러나 연구, 측정 DMEM 또는 DPBS, 같은 다른 셀 미디어에서 실행 될 수 있다 iSCAT 분 비 시스템에 맞게, pH 지시자 페 놀 레드 피해 야 한다 그것은 레이저 광의 흡수 때문에 실험을 방해 수 있습니다로. 또한, 송아지 태아 혈 청 (FCS) 또는 인간 혈소판 lysate (hPL) 같은 보충 iSCAT 탐지를 방해할 수 있는 단백질을 포함. 실험의 원하는 감도 따라 현미경 매체에서 이러한 보충제를 제외 해야 합니다.
iSCAT는 분석의 수 분산형 빛에 의존-모든 단백질에 본질적인 속성-이며 따라서 본질적으로 일반적인. 그럼에도 불구 하 고, 어느 정도의 특이성 단백질 대량14,,2728와 선형 iSCAT 신호 스케일으로 가능 하다. 이 iSCAT 시스템 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 등 fibrinogen14,,2728표준 단백질 견본을 사용 하 여 교정할 수 있습니다. 사실, 아주 최근에, 젊은 외. 28 Piliarik & Sandoghdar14 의 일에 확장 그리고 19 kDa의 대량 해상도와 정확도 약 5 kDa streptavidin (53 kDa) 작은 단백질의 분자량을 결정 하는 iSCAT를 사용할 수 있습니다 나타났습니다. 여러 가지 기존의 접근 특이성의 추가 레벨을 제공 하 여 iSCAT를 보완 추가 수 있습니다. 예를 들어, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 실험 (ELISA), 또는 다른 표면 수정으로 대상 단백질만 검출된16되도록 단백질 바인딩 이벤트를 제한 합니다.
이 프로토콜에서 우리 웨이크업하 시간적 해상도16단일 단백질 수준에서 세포 분 비 조사 iSCAT 현미경 검사 법을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 기술은 일반 이며 어떤 상업적 또는 집에서 만든 현미경에 구현 될 수 있습니다. 단일 분자 형광 접근 달리 메서드가 photobleaching에서 고통을 하지 않습니다 또는 점멸 효과 하지만 그것은 여전히 단일 단백질 감도 달성. 이러한 기능 바이오 센 싱 및 현미경의 분야에서 강력한 도구 iSCAT 확인합니다. 미래의 응용 프로그램 elucidating 셀룰러 통신 또는 자극에 면역 반응 등 복잡 한 세포 상호 작용에 집중할 것 이다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 맥스 플랑크 사회, 알렉산더 폰 훔볼트 교수와 도이치 가운데 (CRC 1181)에 의해 지원 되었다. 우리 감사 합니다 스테파니 Schaffer Universitätsklinikum 에를랑겐에서 제공 하는 Laz388 세포에 대 한 유용한 토론. 우리 감사 합니다 시몬 Ihloff과 막심 Schwab MPL에서 기술 지원에 대 한.
Item/Device | |||
100x / 1.46 NA objective | Zeiss | 420792-9800-000 | alpha Plan Apochromat oil immersion |
20x / 0.4 NA objective | Leica | 566049 | N Plan |
Piezo Stage | PI | P-517k020 | 3-axis stage with 100x100x10µm range |
Diode laser (445 nm) | Lasertack | PD-01236 | |
Optics/Optomechanics | Thorlabs/Newport | – | lenses, mirrors, posts, mounts |
Pinhole | Thorlabs | P30H | |
LED light source | Thorlabs | MCWHL5 | |
Shortpass filter (580 nm) | Omega Optical | 580SP | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
Longpass filter (500 nm) | Thorlabs | FEL0500 | to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation |
70R/30T beam splitter | Newport | 20Q20BS.1 | |
Economy beam splitter | Thorlabs | EBS1 | used for the comparison of fringe effects |
Wedged plate beam splitter | Thorlabs | BSW26 | used for the comparison of fringe effects |
Shortpass dichroic mirror (550 nm) | Edmund Optics | 66249 | |
8R/92T beam splitter | Thorlabs | BP108 | |
CMOS camera | Photonfocus | MV1-D1024E-160-CL | for iSCAT aquisition |
CMOS cameras | Mightex | SCE-B013-U | for bright field / fluorescence aquisition |
Longpass filter (600 nm) | Thorlabs | FELH0600 | |
Computer | Fujitsu Siemens | – | Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD |
Acquisition Software | LabVIEW | – | LabVIEW 2016 Suite |
Analysis Software | Matlab | – | Matlab 2014 Suite |
Plasma Cleaner | Diener | Diener pico | |
Incubator | Binder | Model CB | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Reagent/Material | |||
RPMI 1640 medium | Gibco | 11835063 | without phenol red |
HEPES Buffer Solution (1M) | Sigma Aldrich | 59205C | |
Cover slides | Marienfeld | 107052 | |
Glass bottom culture dishes | ibidi | 81158 | |
Fluorescent Microspheres | Invitrogen | F8821 | used for calibration |
Immersol immersion oil | Zeiss | 444960 | |
Propidium iodide stain | Invitrogen | R37108 | |
Small pipette tips | Eppendorf | 30075005 | |
Flexible pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Ethanol, 99.8% | Fisher Scientific | E/0650DF/15 | |
Sodium hydroxide, pellets | Sigma Aldrich | 221465 | for preparing 0.2M NaOH solution |