Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Andr&#233; Gemeinhardt; Matthew P. McDonald; Katharina K&#246;nig; Michael Aigner; Andreas Mackensen; Vahid Sandoghdar

doi:10.3791/58486

JoVE Journal > Engineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

工程学

ללא תווית הדמיה של יחיד חלבונים מופרש מתאי חי דרך iSCAT מיקרוסקופ

Published: November 20, 2018

doi:

10.3791/58486

André Gemeinhardt¹, Matthew P. McDonald^1,2, Katharina König^1,3, Michael Aigner⁴, Andreas Mackensen⁴, Vahid Sandoghdar^1,3

¹Max Planck Institute for the Science of Light (MPL), ²Area of Scientific Learning,Milligan College, ³Department of Physics,Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg, ⁴Department of Internal Medicine 5, Hematology and Oncology,Friedrich Alexander University Erlangen-Nuremberg (FAU), University Hospital Erlangen

Summary

אנו מציגים עבור זיהוי אופטי בזמן אמת של חלבונים יחיד ללא תווית פרוטוקול כפי שהם המופרשים מתאי חי. זה מבוסס על מיקרוסקופ interferometric פיזור (iSCAT), אשר יכול להיות מיושם למגוון רחב של מערכות ביולוגיות שונות ותצורות.

Abstract

נדגים מיקרוסקופ interferometric פיזור (iSCAT), שיטה מסוגלת גילוי יחיד ללא תווית חלבונים המופרשים מתאים חיים בודדים בזמן אמת. ב פרוטוקול זה, נסקור את השלבים הבסיסיים למימוש במיקרוסקופ iSCAT משלים אותו עם ערוצי הדמיה נוספים כדי לנטר את הכדאיות של תא שנבחנה. בעקבות זאת, אנו משתמשים השיטה לגילוי בזמן אמת של חלבונים יחיד כפי הם מופרשים מן התא החי נדגים עם קו B-cell immortalized (Laz388). הצעדים הדרושים לגבי ההכנה של מיקרוסקופ, לדוגמה, כמו גם הניתוח של נתוני ההקלטות הם דנו. פרוטוקול וידאו מדגים שמיקרוסקופ iSCAT הזה מציע שיטה פשוטה ללמוד הפרשת ברמת מולקולה בודדת.

Introduction

חלבוני המופרש לשחק תפקיד משמעותי תהליכים פיזיולוגיים שונים¹. מסיבה זו, הם הם למדו באופן שגרתי של אנסמבל קולקטיבית (פרוטאומיקס) או ישויות נפרדות²^,³. פרוטאומיקס באופן מסורתי חוקר את כל סידרת חלבונים המצויים מערכת ביולוגית מסוימת דרך למשל, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה), cytometry זרימה או ספקטרומטר מסה⁴^,⁵^, ⁶. חלבונים יחיד, מצד שני, בדרך כלל מזוהים באמצעות מגוון של שיטות המבוססות על קרינה פלואורסצנטית⁷^,⁸,⁹^,פלזמוניקה¹⁰או אלקטרון קריוגני¹¹ microscopies. כל הטכניקות הללו להשתמש מכשירים מורכבים, תיוג או שניהם, לעתים קרובות חוסר דינמיקה מידע כפי שהם רק לספק מידע לטווח ארוך על מערכת שנבחנה.

כאן אנו משתמשים iSCAT¹²^,¹³ מיקרוסקופ הגיוני הפרשה חלבונים בודדים עם פחות משנייה רזולוציה טמפורלית¹⁴. חשוב, הטכניקה מזהה האות פזורים חלש מהותי בכל¹²^,של חלבון¹⁴. כמות האור bioparticle קטן מחליקי להרחבה מדרגית עם פולריזביליות שלה. בהנחה כי הצורה של חלבון ניתן לקרב את ערכיהן על ידי מטוס פיזור יעיל הספרה¹⁴^,¹⁵^,¹⁶, וזה שונה חלבונים יש מדדי השבירה דומה מאוד, האות נמדד ניתן ישירות מחובר משקל מולקולרי (MW) של החלבון. כיול אמפירי של ניגודיות iSCAT לעומת מולקולרית משקל על ידי הפניה מדידות מאפשרת להבחין חלבונים בגדלים שונים. iSCAT ניסויים יכולים בכשלי בקלות על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ¹⁷^,¹⁸, ריאגנטים immunosorbent, כמו גם תוויות פלורסנט או פיזור כדי לאפשר זיהוי מסוים של כל חלבון של עניין¹⁴ ^, ¹⁷ ^, ¹⁹.

בעקרון, פונקציות iSCAT על ידי הגברה אור של חלבון מפוזר חלשים באמצעות ערבוב interferometric עם גל הפניה משנית. עוצמת שזוהו () ב- iSCAT מיקרוסקופ מתואר על ידי

איפה הוא עוצמת האירוע, הוא מקדם עבור התרומה של גל הפניה, מסמל את הכוח פיזור של הננו-אובייקט שנבחנה, ו המופע. ההתחלתי בין מפוזרים, הפניה גלי¹⁴. גם ששודרו או משתקף הגב התקרית אור משמשת בדרך כלל כגל הפניה, שם בכל מקרה ומקרה חשבונות עבור transmissivity או השתקפות של תא הדגימה, בהתאמה. המונח הוא יחסי של החלבון פיזור סעיף קרוס, יכול להיות מוזנחים לעומת המונח קרוס. לפיכך, הגדרת עבור מלאה התאבכות הורסת, האור שזוהו ניתנת על ידי איפה זה את העוצמה הפניה, הוא עוצמת ההפרעה.

מיקרוסקופ iSCAT מציע שיטה מצוינת ללמוד תהליכים ביולוגיים ברמת מולקולה בודדת. כדוגמה, אנחנו חוקרים תאים Laz388 – וירוס אפשטיין בר (EBV) הפך לימפוציטים B תא קו²⁰^,²¹ – כפי הם מפרישים חלבונים כגון נוגדנים IgG¹⁶. עם זאת, השיטה הינו מידע כללי, ניתן להחיל על מגוון רחב של מערכות ביולוגיות אחרות. iSCAT הוא מטבעו לא ספציפי יכול לזהות כל חלבון או ננו-חלקיק או שזה ניתן להרחיב עם שיטות נפוצות functionalization פני השטח לצורך זיהוי ספציפי או מרובבת. את הפשטות ואת היכולת להיות בשילוב עם טכניקות אופטיים אחרים, כגון מיקרוסקופ פלורסצנטיות, להפוך iSCAT משלימים כלי רב ערך ב ביולוגיה של התא.

Protocol

התראה: אנא קרא כל גליונות נתונים גשמי בטיחות (MSDS) לפני שימוש בכימיקלים, להתבונן כל נוהלי בטיחות המתאים, ללבוש ציוד מגן אישי (משקפי בטיחות לייזר, הגנה העין, כפפות, מעילי מעבדה) לפי הצורך. 1. לבנות את iSCAT מיקרוסקופ16,18 הערה: המיקרוסקופ iSCAT מורכב בדרך כלל מלכודת ששונה מיקרוסקופ הפוכה. בקצרה, לייזר ממוקד למטוס חזרה מוקד של יעד מפתח נומרי גבוהה (NA) ומשמש העדשה הדמיה כדי למקד את האור מפוזר-הגב של החלקיק על גבי שבב המצלמה. באופן כללי, מיקרוסקופ שדה רחב זה יכול להיות נבנה מאפס או בהתבסס על מיקרוסקופ הפוכה קיימים. פרוטוקול זה מכסה את השלבים חיוני להבין את ההתקנה, ואילו שינויים בחומרה בשימוש אפשריים. תיאור מפורט יותר של מכלול של מיקרוסקופ iSCAT ניתן למצוא בעבודתם של ארויו. et al. 18. התראה: מיקרוסקופ iSCAT כרוך של הכיתה IIIB למקור אור לייזר Class IV. הגנה העין המתאים הכרחי בעת בניית ויישור של מיקרוסקופים אופטיים. במהלך האספה מיקרוסקופ, ודא כי הנתיב של קרן הלייזר ישרה ולא מכופפת, לא הסיט כפי רכיבים אופטיים חדשים מתווספים. להגדיר את הנתיב תאורה של המיקרוסקופ. באמצעות טבלה אופטי לח וגוש מתכת נוקשה, לבנות של מיקרוסקופ דוגמת שלב18 המשלבת יעד מפתח נומרי גבוהה (NA) (100 X / 1.46 NA) ואת יחידת תרגום זה מאפשר תרגום מדגם לרוחב, כמו גם שינוי המוקד מיקום עבור המטרה.הערה: הפעולה של מיקרוסקופ iSCAT על גבול גילוי חלבונים יחיד הוא רגישים מאוד ויברציות חיצוניים. שלב אלמנט פייזו centrosymmetric התומך המדגם מכל הכיוונים מומלץ להגביל את excitations אקוסטית של המדגם אחרת שעלול לסכן את מוקד ויציבות לרוחב. איור 1 מציג שלב מדגם מתאים, כולל יחידת תרגום piezo ואת המטרה. בנוסף, מומלץ כי טעינות מסיבי ויציב משמשים עבור כל הרכיבים אופטי דנו בשלבים הבאים. לרכיבים אלה זמינים מספקי האופטיקה מסחרי. השתמש בעדשה גופיה אורך מוקד 50 ס מ (עדשה רחבה-שדה) של 45° (אנכי) מצמד מראה למקד את האור של לייזר דיודה ב ננומטר אורך גל 445 למטוס חזרה מוקד של המטרה. זה יוצר קרן מקבילות-המוקד קדמי של המטרה, יהפוך מקור תאורה iSCAT. במידת הצורך, לסנן את הלייזר במרחב לפני העדשה 50 ס מ באמצעות 30 מיקרומטר חריר או סינגל מוד סיבים. להחיל droplet של טבילה שמן על המטרה ומניחים על coverslip זכוכית במטוס מדגם של השלב מיקרוסקופ. זה יגרום בקרן שמשקף למטה דרך המטרה הדמיה.הערה: ההשתקפות נובע הממשק זכוכית-אוויר על פני השטח העליון של coverslip הדגימה, ישמש כבסיס עבור קרן הפניה iSCAT. שאריות לכלוך או אבק על פני השטח של coverslip יהיה להצמיח מקורות נקודת פיזור, אשר לסייע מיקוד נכון של המטרה הדמיה בשלבים הבאים.התראה: הרוב המכריע של אור הלייזר משדרת דרך coverslip, נוסע ישר למעלה מהמטרה. במקום ‘ מפזר ‘ סימונים אטום (למשל., נייר קלף) מעל coverslip כדי למזער את הסיכון של פגיעה של אור הלייזר. איור 1: הבמה מדגם iSCAT. התמונה מציגה את בלוק אלומיניום מאסיבי שבו נטענה יחידת תרגום אלמנט פייזו (שחור) כמו גם ה-100 ממורכז x אובייקטיבי. השלב 3-ציר piezo מאפשר מיקום מדויק של המדגם במישור המוקד של המטרה. התמקדות גס מבוצעת על ידי סיבוב צינור משורשרות שבו נטענה המטרה (לא מתואר). הבניין ממוקם על שולחן אופטי עם ארבעה כנים פלדה מעל המראה צימוד 45°. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. להגדיר את הנתיב הדמיה של המיקרוסקופ. להציג את antireflection (AR)-מצופה קרן ספליטר (השתקפות 70%, 30% שידור) בזווית של 45 מעלות ביחס הקורה האירוע ולאחר כ-10 ס מ לאחר העדשה שדה רחב. הצבע הציפוי AR לכיוון מקור לייזר. זה משדר את קרן התקרית, משקף את ההפניה, מפוזרים הקורות בזווית של 90 מעלות על הקורה התקרית.הערה: קרן מצופים AR ו/או תקוע מפצלי מומלצים כמו לברורות משמעותית תופעות נלוות יכולה להתרחש בעת שימוש קרן פיצול קוביות, או מפצלי הקרן מישורי ללא ציפוי. ראו דיון לפרטים נוספים. אם רצונך בכך, בכל הקורה משתקף לא רצויים הנובעים מן הצד האחורי של המפצל קרן עשויים להיחסם על ידי השימוש הסרעפת איריס. מפצל בעובי הקורה תציג לעקירה קרן משמעותית כך הלייזר לא ייתכן שתזין המטרה ישר יותר. במידת הצורך, ליישר מחדש את הנתיב של קרן הלייזר לפני המפצל קרן כדי להבטיח התפשטות נכונה דרך המטרה.הערה: ייתכן המפצל קרן גם להוסיף לפני העדשה שדה רחב, השלב מיקרוסקופ היא תמוקם (שלב 1.1.2.), כך יהיה הקרן לא שנעקרו מאוחר יותר. בשלב זה, למקד את הזרוע הדמיה של interferometer ולהבטיח כי המטוס מדגם של המצלמה הם parfocal. המקום של f קעורה = ס מ-45 עדשה במיקום 5 ס מ אחרי העדשה שדה רחב בנתיב קרן התקרית. זה יגרום בקרן מקבילות הזנת את הפתח האחורי של המטרה. עם מסך להציב את הזרוע משתקף של interferometer, הזז המטרה בכיוון אנכי כדי למצוא את המיקום מוקד גס. המטרה היא בפוקוס כאשר קרן להכות על המסך היא ממוקדת.הערה: איור 2 מציג תיאור סכמטי של תהליך זה. להסיר את שתי האותיות = ס מ-45 העדשה ואת המסך בסיום התמקדות גס.הערה: במקום להשתמש עדשה אורך מוקד שלילי, שדה רחב העדשה עצמה ייתכן מניחים על הר מטלטלין ויש העביר את הנתיב קרן בשלב זה. עם זאת, כדי להשיג את תצורת מיקרוסקופ היציב ביותר, מומלץ להחזיק את העדשה שדה רחב בעמדה קבועה. להוסיף בתס השני = 50 ס מ גופיה העדשה למקד את האור מפוזר, כדי collimate האור המשתקף על החיישן של מצלמת CMOS. ודא כי העדשה מונחת 50 ס מ על המטוס חזרה מוקד של המטרה כדי מחדש collimate קרן הפניה ולהתמקד האור מפוזר. המקום CMOS צ’יפ 50 ס מ בלבד f = 50 ס”מ העדשה ומקם קרן ישירות על גבי האמצע של השבב.הערה: הפרמטרים הבאים משמשים בדרך כלל עבור הדמיה. הכוח פלט של הלייזר (ננומטר אורך גל 445) מוגדר כ- 100 מגוואט. ספליטר חריר, קרן להחליש את האור המשודר כך כוח יעיל הזנת המטרה היא כ 9 mW. הקוטר קרן במיקום מדגם מסתכם 6 מיקרומטר. עם העדשה הדמיה בשימוש, ההגדלה יעיל של המערכת הוא כ- 300 x. גודל התמונה על שבב CMOS מוגדר 128 × 128 פיקסלים בתוך האזור מואר, וכתוצאה מכך שדה ראייה של 5 × 5 מיקרומטר2. איור 3 מראה סכימטי של המיקרוסקופ iSCAT שהרכבתם. איור 2: התמקדות גס של המיקרוסקופ iSCAT. התרשים מציג את הסידור של אופטיקה כדי לעזור להכניס את המערכת המיקוד. הצד האחורי מצופים AR של המפצל קרן (70/30 BS) מסומן באדום. מרחקים חשוב מסופקות בצבע ירוק. אורכי מוקד (f) של העדשות להשתמש מסומנים. שלבים 1.2.6 – 1.2.7 מתווספים רכיבים בתיבת מקווקו כחול. העדשה קעורה (משמש מחדש collimate קרן iSCAT מתכנסים) ואת המסך יוסרו מאוחר יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: מיקרוסקופ iSCAT. התרשים מראה המיקרוסקופ iSCAT התאספו לגמרי. הצד האחורי מצופים AR של המפצל קרן (70/30 BS) מסומן באדום. מרחקים חשוב מסופקות בצבע ירוק. אורכי מוקד (f) של העדשות להשתמש מסומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. להגדיר את ערוצי הדמיה נוספים.הערה: סעיף זה מוסיף נתיב נוסף הדמיה במיקרוסקופ המאפשר התבוננות שטח גדול המקיף את הלייזר iSCAT באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר, וכדי לפקח על הכדאיות התא באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. כמה הפלט של מקור אור LED (כ-500 nm < λ < 580 nm) לתוך ארוך פועלים מרחק 20 X / 0.4 נה המטרה ולאחר התקנת רכיבים מכניים מעל תא הדגימה המאפשרים התמקדות ובמיקום לרוחב של הפלט LED אל לדוגמה. ודא כי ה-LED הפלט של ספקטרום מכסה את טווח עירור של סמן מוות התא (propidium יודיד (PI)), לא מפריע שלה קרינה פלואורסצנטית (λ > 600 ננומטר). השתמש במסננים אופטי במידת הצורך. להזיז את המטרה העליונה רוחבית כך העליונה (wide-שדה) ויעדים התחתון (iSCAT) הן קוליניאריות. זה נקבע על ידי הצבת מסך תחת המטרה נמוכה יותר ולמקסם את עוצמת האור LED המשודרת על המסך. מקום λ = 550 ננומטר מעברים קצרים ודיקרואיק זוהר ראי (SPDM) לפצל את נורית המשודרת אור מהנתיב לייזר iSCAT. פצל קרן זו שני ערוצים עם מפצל כמסך קרן reflective/92% (BS) 8%. הנתיב 92% הוא הערוץ פלורסצנטיות ומשמש הנתיב 8% עבור שדה בהיר הדמיה. תמונה בערוץ בהיר-שדה אל מצלמת CMOS באמצעות f = עדשה כפיל אכרומטי 5 ס מ. תמונה בערוץ זריחה על מצלמת CMOS נפרד באמצעות f = עדשה כפיל אכרומטי 5 ס”מ ו λ = 600 ננומטר מסנן פס ארוך כדי לחסום את האור עירור. איור 4a מראה סכימטי של המיקרוסקופ שהורכב במלואו כולל כל הערוצים הדמיה. איור 4: מיקרוסקופ iSCAT של חלבונים מופרש על ידי תאים בודדים. (א) סכמטי של המיקרוסקופ תיאר בפרוטוקול. עיין בסעיף 1 לקבלת מידע נוסף. קיצורים: LED, דיודות פולטות אור; SPF, מסנן לעבור קצר; obj, המטרה; SPDM, המראה ודיקרואיק זוהר מעברים קצרים; BS, קרן הפיצול; LPF, מסנן זמן לעבור; BF, בהיר-שדה; עבור חיל הים, זריחה; C1-C3, מצלמה 1-3. (b) ברייט-שדה תמונה של אחת Laz388 תא 4 מיקרומטר מן iSCAT שדה הראייה (מתואר על ידי ריבוע לבן). התמונה נלקחה על-ידי מצלמה C3, סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר (ג) זריחה תמונת באותו אזור שמוצג (b) עם העמדה של התא המסומן באמצעות עיגול לבן. היעדר קרינה פלואורסצנטית מציין התא הוא בר קיימא. התמונה נלקחה על-ידי מצלמה C2, סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (ד) iSCAT גלם המצלמה תמונה תמונה עם זמן החשיפה 80 µs. התמונה נלקחה על-ידי מצלמה C1. (ה) iSCAT תמונה של אותו אזור לאחר חיסור רקע ייתכן כפי שמתואר במקטע דיון. התמונה היה משולב מעל 1000 רציפים raw מסגרות (ד) עם זמן המסגרת הסופית של 400 ms, מגלה את חספוס בפני השטח של coverslip זכוכית. (נ) המתאימה iSCAT דיפרנציאלית תמונה המציגה את האירוע מחייב של חלבונים 2 אל coverslip. התמונה נבנתה על-ידי חיסור שתי תמונות מסונן ברציפות (e). גודל ברים (ד’), (ה), ו (נ): 1 מיקרומטר. איור זה כבר ממאמרו של מקדונלד, ד. נ. et al. 16. זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. להגדיר את המחשב והתוכנה. חיבור כל המצלמות למחשב. להתקין חבילות מנהלי התקנים המתאימים, להשיג/כתיבה תוכנה לשליטה שלהם.הערה: חומרה מתאימה הוא הכרחי עבור רכישות במהירות גבוהה. לכל הפחות, מומלץ מעבד מרובה ליבות, 16 ג’יגה-בתים של זיכרון RAM, מסגרת תופש כרטיס ו דיסק של מצב מוצק לאחסון נתונים. להתבונן בתמונה iSCAT על המצלמה CMOS, ודא שהוא בפוקוס על ידי מציאת שרידי אבק או לכלוך חלקיקים על coverslip זכוכית. ודא התמונה של החלקיק הוא שנקודה באופן מעגלי סימטרי להפיץ את הפונקציה (PSF).הערה: הסיבה העיקרית PSF באופן שאינו מעגלי סימטרי היא כי קרן הלייזר אינו מזין את המטרה ישר אבל בזווית קטנה ביחס לציר האופטי. זה מתוקן על-ידי התאמת את הזווית ואת המיקום של קרן התקרית עם המראה צימוד 45°. להשוות את תמונות המצלמה של השדה-הבהירים ואת הערוצים קרינה פלואורסצנטית. ודא כי שניהם הם בפוקוס ולא להציג באותו האזור. ודא כי המיקום של הלייזר iSCAT במרכז התמונה ושים לב של מיקומו לצורך סימוכין בעתיד. ראה איור 4b – 4f עבור המצלמה טיפוסי תמונות.הערה: השתמש דגימת תאים או חרוזים פלורסנט למצוא מוקד בין שני הערוצים. זמנית להסיר את המסנן לונג-מעבר קרינה פלואורסצנטית כדי להתאים את המערכת. המוקד עבור הדמיה המקובלת של התאים צריך להיות מעט גבוה יותר מאשר במישור המוקד iSCAT. כדי לפצות על כך מבלי להזיז את המטרה, תחסיר המצלמות עמדותיהם המוקד של האותיות המתאימות שני = עדשות 5 ס מ. להגדיר את הפרמטרים הדרושים המצלמה. השתמש בקצב קבוע מסגרת והפוך כלי רווח, תיקון תוכנה.הערה: הפרמטרים הבאים משמשים: המצלמה iSCAT מוגדר 5000 מסגרות לשנייה (fps) עם זמן חשיפה של 80 µs. כפי שהוזכר לעיל, גודל התמונה הוא 128 × 128 פיקסלים. מצלמות שדה בהיר וגם קרינה פלואורסצנטית פועלים בגודל מסגרת מלאה (1280 × 1024 פיקסלים). שדה ברייט הדמיה מבוצע עם זמן חשיפה 20 ms. המצלמה פלורסצנטיות מוגדר זמן החשיפה 750 ms, 5 מסגרות רצופים צבר כדי ליצור תמונה אחת סופית. ברייט-השדה ותמונות פלורסצנטיות נרכשים במרווחי זמן קבועים 20 s זמן. 2. הכנת הניסוי הכן המדיום מיקרוסקופ מניות. להוסיף 25 מ של HEPES בופר (1 מול/ליטר) 975 מ של RPMI 1640 מדיום כדי לקבל הסופי של 1 ליטר של 25 mmol/L HEPES פתרון. לחלופין, השתמש מדיום מאגר עם HEPES כבר נכלל.הערה: HEPES משמש כדי לשמר את ערך ה-pH של המדיום במהלך מדידה בתנאי הסביבה (למשל, מחוץ אינקובטור וללא אספקה קבועה של2 CO). . קח את aliquot של הפתרון לצורך ניסוי ולתת לו להידלק בטמפרטורת החדר. 2 מיליליטר בינוני מספיקה. לשמור על הפתרון המניות הנותרים 4 ° C. הכינו את cuvette במיקרוסקופ.הערה: השלבים הבאים מתארים את ההליך עבור בעל מדגם לפי הזמנה הכוללת צלחת הבסיס אלומיניום, צלחת cuvette אקריליק זה גם פותר את coverslip וגם זוגות זה positioner 3D פיזואלקטריים. תרבות סטרילי זמינים מסחרית מנות עם חלק תחתון זכוכית עשוי גם לשמש.הערה: איור 5 מציג תמונות של בעל מדגם לפי הזמנה. קח coverslip החדש של מיקרוסקופ, לשטוף אותו עם מים יונים (DI-מים), אתנול. האוויר יבש השקופית עם חנקן או נשוף אוויר. לנקות את coverslip באווירה פלזמה חמצן (לחץ גז mbar 0.3) למשך 10 דקות בעוצמה 500 W RF. פעולה זו מסירה את כל הטמאים אורגני מפני השטח. לנקות את המנה cuvette אקריליק במועט זה 0.2 מול/ליטר NaOH פתרון עבור 10 דקות יש לשטוף במים DI. להרכיב את בעל מדגם, לכסות את זה עם פלסטיק פטרי עד צורך בניסוי. איור 5: בעל מדגם לפי הזמנה- (א) מדגם בעל רכיבים: תבשיל cuvette אקריליק (1); (2) פלטת בסיס אלומיניום; (3) החזקת ברגים; (4) סיליקון o-ring; (5) coverslip. (b) התאספו מלא בעל מדגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. להכין את המיקרוסקופ. להפעיל את הלייזר תאורה iSCAT, את החיובי-שדה/זריחה תאורה LED, מצלמות, ברכישת המחשב/התוכנה. לחסום את קרן הלייזר במיקום לפני המטרה. ודא כי ה-100 X / 1.46 נה המטרה היא נקייה. אם לא, השתמש עדשה ניקוי מגבונים ואתנול כדי לנקות את המטרה לפי הנחיות היצרן. למרוח טיפה של שמן טבילה על המטרה מיקרוסקופ. . קח את בעל מדגם (התאספו בסעיף 2.2) והר בזהירות זה על הבמה piezo של המיקרוסקופ iSCAT כך coverslip הדגימה היא מתמקדת המטרה מיקרוסקופ. להיות קשוב וזהיר לא לגרום נזק לעדשה אובייקטיבי. הדקו את יחידת positioner פיזואלקטריים עם ברגים האגודל תוך הבטחת היצרן שצוינו מומנט כוח מרבי לא חריגה. להוסיף 1 מ”ל של מיקרוסקופיית מניות בינוני (מוכן בסעיף 2.1). cuvette. להוסיף 2 טיפות של propidium יודיד כתם למדיום16,22סמן מוות התא. החסימה של הלייזר, להכניס את המערכת המיקוד. תחילה, ודא כי המטרה היא ממוצבת על המרחק הנכון coverslip מאת וחזור על שלבים 1.2.3. – 1.2.5. (איור 2). לאחר מכן, לכוונן את המוקד עם ציר z של השלב piezo. לאשר כל ההגדרות עבור מקורות אור, מצלמות, התוכנה מוגדרות בצורה נכונה. זה כולל פרמטרים כגון עוצמת הלייזר, LED עוצמת, קצב תמונות מצלמה, מצלמה פעמים חשיפה או תוכנה שמירת נתיבים.הערה: שמירת וידאו בקצבי מסגרת גבוהה יכול לייצר גדלי קבצים גדולים. ודא די שטח דיסק חינם במחשב. לחסום את קרן הלייזר שוב. המיקרוסקופ עכשיו הוא מוכן לניסוי. הכינו את התאים.הערה: Laz388 תאים20 מתורבתים בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% עגל עוברית סרום (FCS), חומצות אמינו, פירובט ואנטיביוטיקה. התאים מודגרת-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 , הן לפצל וסיפק בינונית טרייה כל 2-3 ימים23. לקחת את הבקבוק התרבות תאים מן החממה, תשאף בינוני המכיל כ עונה 1 פרק 106 תאים. כדי לקבוע את עוצמת הקול הנכון, לכמת את הריכוז של התרבות תאים על-ידי שימוש hemocytometer. לערבב את הפתרון תא עם 10 מ”ל של מדיום RPMI 1640 בטמפרטורת החדר, centrifuge את הדגימה ב g x 300 במשך 7 דקות. בזהירות לחלץ ולמחוק את תגובת שיקוע תוך הקפדה כי בגדר של תאים מרוכז נשאר ללא הפרעה. חזור על שלבים 2.4.2. – 2.4.3. עם גלולה מרוכזת של תאים. מחדש להשעות את התאים במדיום מיקרוסקופ מניות 0.5 mL (מוכן בסעיף 2.1)., מיד להשתמש בהם בניסוי. 3. iSCAT מיקרוסקופיה של הפרשת תאים ודא כי קרן הלייזר נחסמת כדי למנוע את התאים ישירות נחשפים אור הלייזר iSCAT. להזריק את התאים לתוך cuvette הדגימה. להזריק כ 3 µL של המדגם תא (סעיף מוכן ב 2.4.) ממורכז לתוך cuvette הדגימה. בעדינות לגעת בקצה פיפטה כדי coverslip ולהזריק לאט את הפתרון הסלולרי. לאפשר את התאים להתיישב על coverslip.הערה: השתמש טיפים פיפטה נפח קטן (10 µL) או טיפים ג’ל העמסה ארוך, גמיש. ודא כי הצפיפות של תאים מתחת כ 1 התא לכל 500 µm² כך מדידות תא בודד, לא מושפעים בתאים מרובים באזור הסובב את הלייזר iSCAT. אם מספר התאים נמוך מדי, חזור על שלב 3.2.1. עד מספר מספיק זמין. אם הכיסוי של תאים הוא צפוף מדי, להשתמש זריקה של µL כ-20 נוספים מיקרוסקופ בינוני כדי לפזר את התאים על פני coverslip. באמצעות את אלמנט פייזו positioner, להעביר את הדגימה רוחבית למיקום תא סגור (כ 10 מיקרומטר) iSCAT שדה הראייה. ודא כי התא לא להיכנס iSCAT שדה הראייה כמו חשיפה ישירה אור הלייזר nm 445 עלולים להיות מזיקים של התא. להשתמש בתמונות בהירים- ושדה קרינה פלואורסצנטית לאתר ולוודא הכדאיות של התא25.הערה: תא קיימא יש צורה עגולה בתמונה בהירים-שדה ואינו פלורסנט, ואילו מוות תאי הוא הצביע על ידי קרינה פלואורסצנטית חזקה אותות הנובעים הנוכחות של יודיד propidium בתוך התא22. החסימה של קרן הלייזר iSCAT ולהבטיח כי השטח coverslip הוא עדיין בפוקוס. הקף את השולחן בידוד כדי למזער את הסחף, מצמד אקוסטי מהסביבה אמביינט.הערה: האחרון מושגת עם וילונות כבדים אופטי או לוחות אקריליק סביב השולחן האופטי. להתחיל את המדידה על ידי רכישת תמונות ממצלמות iSCAT בהיר-שדה, זריחה. להפוך לאוטומטיות, לשלוט על התהליך באמצעות תוכנות כדי למקסם את היעילות ניסיוני. מפעם לפעם לבדוק את הכדאיות של התא ואת המוקד של המערכת.הערה: בהתאם לייזר בעוצמה, רכיבים אופטיים, הגדרות זמן החשיפה של המצלמה, הלייזר iSCAT עשויים להפריע המצלמה זריחה. אם תופעה זו נצפית, שקול סוגרת את הלייזר iSCAT באופן זמני במהלך פלורסצנטיות התמונה רכישות. 4. ניתוח נתונים הערה: נתוני הניסוי הוא רועש מטבעו, תמונות iSCAT אינם שונים. ישנם מספר מקורות רעש במידה iSCAT טיפוסי, כולל חזית גל עיוותים התקרית מקור האור, חספוס פני השטח של coverslip, וכן רעש המצלמה. המקטע להלן מציג כמה דרכים שבו מקורות רעש אלה יש לתקן באמצעות לאחר העיבוד. בנוסף, לרוחב instabilities מכני של ההתקנה להוביל נתונים רועשת, יש להתייחס בהתאם, כפי שמתואר בסעיף הדיון שלהלן. הניתוחים המתואר מבוצעות באמצעות קבצי script מותאמים אישית של MATLAB. מזער את רעש המצלמה על-ידי סינון הנתונים הגולמיים עם מסנן פורייה הדו-ממדית שתואמות מרחבית גבוהה. הגודל של המסנן צריך להיות מותאם כדי להתאים את תצורת ניסיוני ספציפי (נקבע בעיקר על ידי מפתח נומרי של המערכת).הערה: תכונות בתמונה בעזרת מרחבית גבוהה יותר מאשר מערכת אופטית לנבוע ממקורות חיצוניים (כגון מצלמה read-out רעש), יכול להיות מוזנחים. להמיר את התמונות מצלמה גולמיים ספירות אל לעומת iSCAT.הערה: האות שזיהה את המצלמה הוא . iSCAT חדות מוגדר איפה הוא עוצמת האור הפניה, במקרה זה החלק בא לידי ביטוי coverslip, ו הפרעות בין לבין עוצמת פזורים (). להפריד את האות לתוך , על-ידי חישוב הממוצע הטמפורלי של מסגרות מסוים שבו החלקיקים של עניין אינם נוכחים. התמונה המתקבלת מספקת את האות הפניה .הערה: לחלופין, צעד חיסור רקע הפעיל ניתן לבצע כפי שמתואר בהמשך הדיון. לחשב את הניגוד על פי 12,14,16. ליצור תמונת דיפרנציאלית מתגלגל על-ידי חיסור כל מסגרת רצופים של הפעילות העוקבת שלה.הערה: ממסר אותות מן חספוס פני השטח של coverslip, חזית גל עיוותים יוסרו באופן יעיל בשלב זה כפי שהם קבועים בתוך מסגרות רצופים. ההפרש מתגלגל מסיר אותות אלה שיורית, להשאיר רק את איגודי חלבון המתרחשות ממסגרת אחת לאחרת. זה חיסור רקע דינאמי הוא מועיל הוא לא רגיש נשתל מדגם לטווח ארוך. החלת אלגוריתם שוחרת שיא, אינדקס חלקיקים יחיד לכל אחת מהמסגרות ויוכל לקבוע ניגוד מסוים והמיקום שלהם. השתמש במידע הנאסף בשלב 4.4 כדי ליצור היסטוגרמות של אירועים איגוד חלבון להתייחס שלהם ניגודים שחולצו חלבון המסה באמצעות עקומת כיול הידור של חלבון ידועות דוגמאות14,24.

Representative Results

תיאור סכמטי של מיקרוסקופ iSCAT מוצג באיור 4a. נציג בהיר-שדה, קרינה פלואורסצנטית ותמונות iSCAT גלם מוצגים באיור 4b, 4 c 4 d, בהתאמה16. איור 4e 4f מציגות את התוצאות של הסרת רקע ועיבוד פוסט דיפרנציאלית; שני חלבונים הספוחה גלויים עקיפה-מוגבלת. נקודות באיור 4f. איור 6 הצגת היסטוגרמה של החלבונים שזוהו במהלך 125 s. נתונים אלה התקבלו על-ידי החלת אלגוריתם שוחרת שיא תמונות שנתפסו כדי למנות את האירועים כריכת קטלוג שלהם חדות16. המספר הכולל של חלבונים 503 אותרו. מינים הבא, המופרש מזוהים by comparison with התייחסות מדידות שבוצעו על חלבון מטוהרים פתרונות, או דרך מדידה נוספת עם זכוכית functionalized משטחים14,16. הנתונים iSCAT, לפיכך, ישירות המחש דינמיקה סלולר הפרשת על סולם subsecond16. לדוגמה, מצאנו בעבר כי נוגדנים IgG הם חלק מרכזי של secretome Laz388 ולא משתחררים מהתא בקצב של ca. מולקולות 100 לכל שנייה16. בנוסף, חלקיקים אחרים המתפרסות על-פני טווח kDa 100 – 1000 kDa המופרשים על ידי תאי ה-16. השיטה המתוארת ניתן עוד יותר מועסקים למשל, לחקור את ההדרגה ריכוז המרחבי של הפרשות סביב התא16, או כדי לקבוע את הדינמיקה הטמפורלי של פירוק התאית16. איור 6: כימות של חלבוני המופרש על ידי תא בודד Laz388. ההיסטוגרמה מציגה חלבונים שזוהו במהלך פרק זמן של ניגוד ס’ 125 ערכים צבר בסלי עונה 1 פרק 10-4 חדות (סרגל כחול). סך של חלבונים בודדים 503 נספרו במהלך המדידה הזו. הניסוי היה חוזר על עצמו עשר פעמים עם תוצאות דומות. איור זה כבר ממאמרו של מקדונלד, ד. נ. et al. 16. זכויות יוצרים 2018 אמריקאי כימית בחברה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

אחד ההיבטים הכי קריטי להשגת נתונים שימושי iSCAT היא היכולת למצוא את המיקום מוקד נכונה על פני coverslip, וכדי, יתר על כן, תחזיקו בעמדה הזאת במשך פרקי זמן ארוכים. עושים כך תגרום PSFs והורחבו, אותות iSCAT חלש, וחפצים הקשורים להיסחף ב dynamics ניתוחים. מתברר כי מציאת המטוס מוקד על coverslip נקי, חשופות השטח אינה משימה קלה כפי תכונות פני השטח אינם גלויים רקע קרן הפניה גדול (ראה איור 4 d).

Raw iSCAT תמונות מטושטשות לעיתים קרובות על ידי אותות רקע מפני זיהומים חזית גל במקור עירור, ולא יכול לעכב את היכולת למצוא את המטוס הדמיה הנכון. חיסור פעיל חזית גל היא דרך שימושית כדי לעקוף בעיה זו ולנטר לאחר מכן המוקד iSCAT במהלך מידה¹⁶. דרך אחת לעשות זאת היא דרך אפנון מדגם מרחבית. בקצרה, מחולל אותות חל על גל מרובע 50 הרץ יציאת בקרה חיצונית של השלב piezo, וכתוצאה מכך אפנון מדגם המרחבי בתדר יישומית (290 ננומטר משרעת). המצלמה סינכרונית רכישות מופעלות מאותו מקור, ובשילוב, באמצעות עקרונות הנעילה, התוצאה¹⁴^,תמונת חזית גל-פיצוי¹⁶. התמונה המתקבלת מראה בדרך כלל על חספוס בפני השטח של coverslip (איור 4e). תכונות קטנות שנותרו על הזכוכית לאחר ניקוי ניתן להביא המיקרוסקופ להתמקד. פרמטרים בשימוש בשלב זה חיסור רקע פעיל עשוי להשתנות בהתאם במסגרת שיעור, זמן החשיפה, או חומרה.

כפי שהוזכר לעיל, מומלץ השימוש במפצל באיכות גבוהה קרן בכיוונון iSCAT (שלב 1.2.1.), כמו הדמיה חפצים כמו לברורות או הפרעות הנובעות מפצלי הקרן מישורי דק להשפיע על התמונה ולנער את המדידה. איור 7 מראה השוואה בין במפצל קרן באיכות נמוכה ובאיכות גבוהה. גם תמונות raw iSCAT מציגים באותו האזור coverslip המכילה כמה חלקיקים שיורית. אותו סידור iSCAT שימש כדי ללכוד גם תמונות, רק קרן המפצל היה להחליף. איור 7 א מראה את התמונה הנוצרת על המצלמה על-ידי השימוש עבה (5 מ מ), קרן מצופים AR, ואני תקוע הפיצול. בשל העיצוב wedged, הקרן משתקף מן המשטח האחורי של המפצל קרן במקביל נגד השתקפות הנובעים המשטח הקדמי, לא נכנס המטרה. אין חפצים הפרעות להתרחש. איור 7 ב מציגה את שדה הראייה אותו על הדגימה אך הפעם נעשה שימוש במפצל דק יותר של מישורי קרן (1 מ מ). שתי השתקפויות של משטחים קדמית ואחורית של המפצל קרן מקבילים, מהורה אל המצלמה. הפרעה חפצים הם נראים בבירור.

איור 7: השוואה של תמונות iSCAT מיוצר עם מפצלי הקרן, נמוך-באיכות גבוהה- תמונת raw iSCAT (א) Resulting על-ידי שימוש במפצל קרן עבה מצופה AR, תקוע 5 מ מ. (b) Resulting iSCAT גלם תמונה של אותו אזור על-ידי שימוש במפצל קרן מישורי בעובי 1 מ מ. מפצלי הקרן שני יש את אותו יחס פיצול (השתקפות 50%, 50% שידור). חפצי הפרעות הנובעות השתקפויות פרנל הם נצפו בבירור בתמונה מיוצר עם המפצל קרן מישורי בעובי 1 מ מ. גודל ברים: 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ב פרוטוקול זה נתאר ערכת תאורה שדה רחב עבור iSCAT כמו זה הוא מהיר, קל להבין מאפשר חישה מקבילים על פני שטח גדול¹⁴. גישה נפוצה אחרת היא להשתמש deflectors אקוסטו אופטי (AODs), לסרוק קרן קונאפוקלית מעבר מדגם ה-¹²^,¹⁷. גישה זו מונע את הצורך wavefronts באיכות גבוהה אך מורכבת יותר ניסיוניים הדמיה רחב-שדות קונבנציונלי. יתר על כן, המהירות של תאורה קונאפוקלית מוגבל על ידי AODs. בהתאם לפרמטרים ניסיוני הרצוי, או ערכות תאורה קונאפוקלית או שדה רחב, בעקרון, ניתן להשתמש כדי לזהות יחיד חלבונים המופרשים מתאים חיים.

כפי שפורט ברחבי בפרוטוקול, זה הכרחי כדי למזער את תנודות מכניות לרוחב בשלב הדגימה במיקרוסקופ. אפילו ננומטר סטיות בעמדה של המדגם ניתן להוביל וריאציות במסגרות המצלמה רצופים, לגרום רעש חיצוני משמעותי בתמונה דיפרנציאלית. לכן מומלץ להשתמש במה מיקרוסקופ מכנית יציב וטבלה אופטי לח (שלב 1.1.1.), כדי לכסות את ההתקנה עם וילונות אופטי או לוחות במהלך ניסוי (שלב 3.5.).

ערכת מייצב המוקד הפעיל יכול להיחשב גם למדידות לטווח ארוך. בגישה זו, לייזר השני שולב המיקרוסקופ בסידור גמורה (טיר), לאחר מכן עם תמונה על גבי פוטודיודה רביע. שינויים בפוקוס של המערכת לתרגם displacements לרוחב טיר לייזר ממוקדת דיודה רבעים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בלולאה משוב פעיל כדי לשלוט ציר z של הבמה piezo²⁶. השפעות ארוכות טווח אנכי להיסחף וכך יחוסלו.

מספר שינויים והרחבות ניתן ליישם את הטכניקה הציג לצרכים הספציפיים כתובת ניסיוני. לדוגמה, מיקרוסקופ מסחרי הבמה חממות זמינים זה יכול בקלות להיות שולבו המיקרוסקופ iSCAT עבור הדמיה ארוכת טווח של תאים. ניתן ליישם טכניקות אחרות גם כהשלמה iSCAT הדמיה, כגון וידאו או טיר זריחה microscopies¹⁷. להסתגל במערכת שנבחנה, הפרשת iSCAT מדידות יכול להתבצע בתקשורת תא אחרים כגון DMEM או DPBS, עם זאת, ה-pH אינדיקטור פנול אדום יש להימנע ככל זה יכול להפריע הניסוי בגלל ספיגת אור הלייזר. בנוסף, תוספי מזון כמו סרום עגל עוברית (FCS) או אנושי טסיות lysate (hPL) מכילים חלבונים אשר עלולים להפריע לזיהוי iSCAT. בהתאם רגישות הרצוי של הניסוי, תוספות אלה לא להיות כלולים המדיום מיקרוסקופ.

iSCAT מתבסס על היכולת של analyte פיזור אור – מאפיין זה הוא מהותי כל החלבונים – ולכן הוא מטבעו לא ספציפית. יחד עם זאת, במידה מסוימת היחודיות אפשרי כמו iSCAT סולם אותות באופן ליניארי עם חלבון המונים¹⁴^,²⁷^,²⁸. דבר זה מאפשר הכיול של מערכת iSCAT באמצעות דגימות חלבון סטנדרטית, כגון אלבומין שור (BSA), פיברינוגן¹⁴^,²⁷^,²⁸. למעשה, ממש לאחרונה, ואח צעיר. ²⁸ . יש מורחב על עבודתו של Piliarik & Sandoghdar¹⁴ , הראו כי iSCAT יכול לשמש כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של חלבונים קטן כמו streptavidin (53 kDa) עם רזולוציה המונית של 19 kDa, ברמת דיוק של-5 kDa. מספר גישות קונבנציונליות יוכלו להשלים עוד יותר iSCAT על-ידי מתן רמה נוספת של ירידה לפרטים. כמו למשל, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה), ו/או שינוי משטח אחר, להגביל את חלבון מחייב אירועים כך רק את חלבון המטרה היא זיהתה¹⁶.

ב פרוטוקול זה, אנחנו תיאר איך מיקרוסקופ iSCAT יכול לשמש כדי לחקור את הפרשות סלולריים באותה רמת חלבון יחיד עם רזולוציה טמפורלית subsecond¹⁶. הטכניקה כללי, יכול להיות מיושם על כל מיקרוסקופ מסחריים או מתוצרת בית. בניגוד גישות מולקולה בודדת פלורסצנטיות, השיטה לא סובל photobleaching או למצמץ אפקטים אבל זה עדיין משיגה חלבון יחיד רגישות. תכונות אלה להפוך iSCAT כלי רב עוצמה בתחום של biosensing ומיקרוסקופ. יישומים עתידיים יתמקד שחקרתי אינטראקציות סלולרי מורכבים כגון תגובה חיסונית גירוי או תקשורת סלולרית.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי חברת מקס פלנק פרופסורה של אלכסנדר-פון-הומבולדט, את פתוח (CRC 1181). אנו מודים סטפני שפר-Universitätsklinikum ארלנגן למתן Laz388 תאים, לדיונים שימושי. אנו מודים סימון Ihloff, מקסים שוואב-הזט ב לקבלת תמיכה טכנית.

Materials

Item/Device
100x / 1.46 NA objective	Zeiss	420792-9800-000	alpha Plan Apochromat oil immersion
20x / 0.4 NA objective	Leica	566049	N Plan
Piezo Stage	PI	P-517k020	3-axis stage with 100x100x10µm range
Diode laser (445 nm)	Lasertack	PD-01236
Optics/Optomechanics	Thorlabs/Newport	–	lenses, mirrors, posts, mounts
Pinhole	Thorlabs	P30H
LED light source	Thorlabs	MCWHL5
Shortpass filter (580 nm)	Omega Optical	580SP	to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
Longpass filter (500 nm)	Thorlabs	FEL0500	to modify the spectrum of the LED for fluorescence excitation
70R/30T beam splitter	Newport	20Q20BS.1
Economy beam splitter	Thorlabs	EBS1	used for the comparison of fringe effects
Wedged plate beam splitter	Thorlabs	BSW26	used for the comparison of fringe effects
Shortpass dichroic mirror (550 nm)	Edmund Optics	66249
8R/92T beam splitter	Thorlabs	BP108
CMOS camera	Photonfocus	MV1-D1024E-160-CL	for iSCAT aquisition
CMOS cameras	Mightex	SCE-B013-U	for bright field / fluorescence aquisition
Longpass filter (600 nm)	Thorlabs	FELH0600
Computer	Fujitsu Siemens	–	Core i7 Processor, 16 GB RAM, SSD
Acquisition Software	LabVIEW	–	LabVIEW 2016 Suite
Analysis Software	Matlab	–	Matlab 2014 Suite
Plasma Cleaner	Diener	Diener pico
Incubator	Binder	Model CB
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Reagent/Material
RPMI 1640 medium	Gibco	11835063	without phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Sigma Aldrich	59205C
Cover slides	Marienfeld	107052
Glass bottom culture dishes	ibidi	81158
Fluorescent Microspheres	Invitrogen	F8821	used for calibration
Immersol immersion oil	Zeiss	444960
Propidium iodide stain	Invitrogen	R37108
Small pipette tips	Eppendorf	30075005
Flexible pipette tips	Eppendorf	5242956003
Ethanol, 99.8%	Fisher Scientific	E/0650DF/15
Sodium hydroxide, pellets	Sigma Aldrich	221465	for preparing 0.2M NaOH solution

References

Hathout, Y. Approaches to the study of the cell secretome. Expert Review of Proteomics. 4 (2), 239-248 (2007).
Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405 (6788), 837-846 (2000).
Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. Journal of Proteomics. 73 (12), 2291-2305 (2010).
Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
MacBeath, G. Protein microarrays and proteomics. Nature Genetics. 32, 526-532 (2002).
Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8 (4), 247-258 (2008).
Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
Borisov, S. M., Wolfbeis, O. S. Optical biosensors. Chemical Reviews. 108 (2), 423-461 (2008).
Dantham, V. R., Holler, S., Barbre, C., Keng, D., Kolchenko, V., Arnold, S. Label-Free Detection of Single Protein Using a Nanoplasmonic-Photonic Hybrid Microcavity. Nano Letters. 13 (7), 3347-3351 (2013).
Zijlstra, P., Paulo, P. M. R., Orrit, M. Optical detection of single non-absorbing molecules using the surface plasmon resonance of a gold nanorod. Nature Nanotechnology. 7 (6), 379-382 (2012).
Rickgauer, J. P., Grigorieff, N., Denk, W. Single-protein detection in crowded molecular environments in cryo-EM images. eLife. 6, e25648 (2017).
Lindfors, K., Kalkbrenner, T., Stoller, P., Sandoghdar, V. Detection and Spectroscopy of Gold Nanoparticles Using Supercontinuum White Light Confocal Microscopy. Physical Review Letters. 93 (3), 037401 (2004).
Jacobsen, V., Stoller, P., Brunner, C., Vogel, V., Sandoghdar, V. Interferometric optical detection and tracking of very small gold nanoparticles at a water-glass interface. Optics Express. 14 (1), 405 (2006).
Piliarik, M., Sandoghdar, V. Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites. Nature Communications. 5, 4495 (2014).
Roux, K. H. Immunoglobulin Structure and Function as Revealed by Electron Microscopy. International Archives of Allergy and Immunology. 120 (2), 85-99 (1999).
McDonald, M. P., et al. Visualizing Single-Cell Secretion Dynamics with Single-Protein Sensitivity. Nano Letters. 18 (1), 513-519 (2018).
Kukura, P., Ewers, H., Müller, C., Renn, A., Helenius, A., Sandoghdar, V. High-speed nanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus. Nature Methods. 6 (12), 923-927 (2009).
Ortega Arroyo, J., Cole, D., Kukura, P. Interferometric scattering microscopy and its combination with single-molecule fluorescence imaging. Nature Protocols. 11 (4), 617-633 (2016).
Spindler, S., et al. Visualization of lipids and proteins at high spatial and temporal resolution via interferometric scattering (iSCAT) microscopy. Journal of Physics D: Applied Physics. 49 (27), 274002 (2016).
Lazarus, H., et al. Characterization of a unique cell line (LAZ 221) from human acute lymphocytic ("null" cell) leukemia. 癌症研究. 38 (5), 1362-1367 (1978).
Mackensen, A., et al. Evidence for in situ amplification of cytotoxic T-lymphocytes with antitumor activity in a human regressive melanoma. 癌症研究. 53 (15), 3569-3573 (1993).
Crowley, L. C., Scott, A. P., Marfell, B. J., Boughaba, J. A., Chojnowski, G., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), 647-651 (2016).
Freshney, R. I. Primary Culture. Culture of Animal Cells. , (2005).
Dahmardeh, M., et al. . Unpublished data. , (2018).
Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. American Journal of Pathology. 146 (1), 3-15 (1995).
Bellve, K., Standley, C., Lifshitz, L., Fogarty, K. Design and Implementation of 3D Focus Stabilization for Fluorescence Microscopy. Biophysical Journal. 106 (2), 606a (2014).
Liebel, M., Hugall, J. T., Van Hulst, N. F. Ultrasensitive Label-Free Nanosensing and High-Speed Tracking of Single Proteins. Nano Letters. 17 (2), 1277-1281 (2017).
Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Gemeinhardt, A., McDonald, M. P., König, K., Aigner, M., Mackensen, A., Sandoghdar, V. Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy. J. Vis. Exp. (141), e58486, doi:10.3791/58486 (2018).