Изоляция взрослых спинной ядра для массивно параллельной сингл ядро РНК последовательности
Summary
Здесь мы представляем протокол быстро изолировать высокого качества ядер из свежих или замороженных ткани для вниз по течению массивно параллельной последовательности РНК. Мы включать моющих средств механические и гипотонической механические ткани нарушения и ячейки лизис вариантов, оба из которых могут быть использованы для изоляции ядер.
Abstract
Зондирование экспрессии генов отдельной ячейки позволяет идентифицировать тип ячейки и ячейки состояния. Одноместный клеточной РНК последовательности стала мощным инструментом для изучения транскрипционный анализ профиля клеток, особенно в разнородных тканей, таких как центральной нервной системы. Однако диссоциация методы, необходимые для отдельной ячейки виртуализации может привести к экспериментальные изменения в ген выражение и клеток смерть. Кроме того эти методы обычно ограничены свежие ткани, тем самым ограничивая исследования архивных и био банк материала. Последовательности одного ядра РНК (мяРНК Seq) является привлекательной альтернативой для транскрипционный анализ исследований, учитывая, что он точно идентифицирует типы клеток, позволяет исследование ткани, замороженные или трудно отделить, и уменьшает диссоциации индуцированной транскрипция. Здесь мы представляем высок объём протокол для быстрой изоляции ядер для вниз по течению мяРНК Seq. Этот метод позволяет изоляции ядер из свежих или замороженных спинного образцов и могут быть объединены с двумя платформами инкапсуляции массивно параллельной капелька.
Introduction
Нервная система состоит из гетерогенных групп клеток, которые отображают разнообразные морфологических, биохимических и электрофизиологических свойств. В то время как основная РНК последовательности был полезным для определения ткани-изменения в экспрессии генов в различных условиях, он исключает обнаружения transcriptional изменений на уровне одной ячейки. Последние достижения в одну ячейку транскрипционный анализ анализ позволили классификации разнородные клеток в функциональные группы на основании их молекулярные репертуар и даже могут быть использованы для обнаружения наборы нейронов, которые были недавно активных. 1 , 2 , 3 , 4 за последние десять лет, развитие одноклеточного РНК последовательности (scRNA-Seq) позволило изучение экспрессии генов в отдельных клетках, обеспечивая представление в разнообразии типа клеток. 5
Появление масштабируемых подходов, таких как массивно параллельной scRNA-Seq, предоставил платформ для последовательности разнородных тканей, включая многие регионы центральной нервной системы. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 однако, методы диссоциации одной ячейке может привести к гибели клеток, а также экспериментальные изменения в экспрессии генов. 16 последние работы адаптировала одну ячейку последовательности методов включения сохранения эндогенного транскрипционный анализ профиля. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 эти стратегии были особенно подходит для обнаружения немедленно ранних экспрессии генов (IEG) после сенсорные стимулы или поведение. 3 , 4 в будущем, эта стратегия могла бы также использоваться для изучения динамических изменений в тканях в болезненном состоянии или в ответ на стресс. Из этих методов, последовательности одного ядра РНК (мяРНК Seq) является многообещающим подходом, который не предполагает стресса заставить диссоциации клеток и могут быть использованы на трудно отделить ткани (например, спинной мозг), а также замороженные ткани. 4 , 17 , 18 , 19 адаптировано из предыдущих методов изоляции ядер,20,21,22,,2325 мяРНК Seq обычно использует нарушения быстрого ткани и клетки Лизис в холодных условиях, центрифугирования и разделение ядер от сотовой мусора. 4 ядра могут быть изолированы для вниз по течению виртуализации следующего поколения на нескольких платформах инкапсуляции microfluidic капли. 4 , 7 , 24 , 25 этот метод позволяет для моментального снимка транскрипционный анализ деятельности тысяч клеток в момент времени.
Существует несколько стратегий для выпускать ядра от клеток до изоляции и последовательности, каждый имеет свои собственные преимущества и недостатки. Здесь мы описываем и сравнить два протокола для включения изоляции ядра от взрослых спинного мозга для вниз по течению массивно параллельной мяРНК Seq: лизис моющих средств механические и гипотонической механические lysis. Моющее механические лизис обеспечивает полный тканей срыв и более высокую доходность окончательный ядер. Гипотонический механические лизис включает управляемые степень разрушения тканей, обеспечивая возможность для выбора баланса между количеством и чистоты доходности окончательного ядерного. Эти подходы обеспечивают сопоставимых РНК урожайности, обнаруженных числа генов в ядро и профилирование типа клеток и также может использоваться успешно для мяРНК Seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Конечная цель настоящего Протокола заключается в изоляции ядер, содержащие РНК высокого качества для вниз по течению transcriptional анализа. Мы адаптировали мяРНК Seq методы для того, чтобы профиль, все типы клеток спинного мозга. Первоначально мы обнаружили, что типичных клеток диссоциации м?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана в очной программе NINDS (1 Зия NS003153 02) и NIDCD (1 Зия DC000059 18). Мы благодарим L. Li и воспламенением Dobrott за их техническую поддержку и полезные обсуждения и Kathe C. для рассмотрения рукописи.
Materials
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
| 1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |
References
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- . Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018)
- 10X Genomics. . Single Cell 3′ Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
