並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離
Summary
ここでは、急速に下流の並列 RNA 配列のため新鮮なまたは冷凍組織から高品質の核を分離するためのプロトコルを提案する.我々 オプションを含める洗剤機械と低張性機械組織破壊とセル換散の核の隔離のどちらも使用できます。
Abstract
個々 の細胞の遺伝子発現を調査セルの種類および細胞の同定ができます。単一細胞 RNA シーケンスは、中枢神経系など異種組織の特に細胞の転写プロファイルを勉強するための強力なツールとして浮上しています。ただし、セルを 1 つのシーケンスに必要な解離メソッドは、遺伝子発現と細胞死の実験的な変更につながることができます。さらに、これらのメソッドは、一般にアーカイブに関する研究とバイオ銀行材料が少なくて、新鮮な組織に制限されます。単一核 RNA シーケンス (Seq snRNA) は転写研究、それが正確に細胞の種類を識別する、冷凍または分離することは困難である組織の研究を許可を与えられた魅力的な代替され、解離による転写。ここでは、提案する下流 snRNA シーケンスの核の急速な隔離のための高スループット プロトコルこのメソッドでは、新鮮なまたは冷凍脊髄由来の核の隔離を有効にし、2 つの並列の液滴カプセル化プラットフォームと組み合わせることができます。
Introduction
神経系は、形態学的、生化学的、および電気生理学的特性の多様な配列を表示するセルの異種グループで構成されます。一括 RNA シーケンスは、異なる条件下での遺伝子発現の組織全体にわたる変更を決める際に有用されている、単一細胞レベルでの転写の変化の検出ができなくなります。単一細胞の転写解析における最近の進歩は、異種細胞の機能グループ分子をレパートリーに基づく分類を有効にし、最近活躍していたニューロンのセットを検出にも利用できます。1,2,3,4過去 10 年間単一細胞 RNA シーケンス (Seq-scRNA) の開発が有効に細胞タイプの多様にビューを提供する個々 の細胞における遺伝子発現の研究。5
超並列 scRNA-Seq などの拡張性の高いアプローチの出現は、中枢神経系の多くの地域を含むシーケンス異種組織のプラットフォームを提供しています。6,7,8,9,10,11,12,13,14,15ただし、単一セル解離メソッドは、遺伝子発現の実験的変化と同様、細胞死につながることができます。16最近の作品は、内因性転写プロファイルの保存を有効にする 1 つのセルの配列方法を適応しています。1,3,4,17,18,19これらの戦略は、前初期遺伝子 (IEG) 発現次の感覚的な刺激や動作を検出するために特に適しています。3,4将来、この戦略も使える組織病気の状態やストレスへの応答のダイナミックな変化を検討します。これらのメソッドの核 RNA シーケンス (Seq snRNA) はストレスを誘発する細胞解離を伴わない、(脊髄) などの組織を分離することは困難として冷凍で使用できる有望なアプローチ組織。4,17,18,19核分離従来から適合、20,21,22,23,25 snRNA Seq 通常利用して急速な組織の混乱とセル細胞の残骸から核を分離、遠心分離、冷たい条件の下での換散。4核は下流の次世代シーケンシング複数マイクロ液滴のカプセル化プラットフォーム上の分離できます。4,7,24,25のこの方法はセルの何千もの転写活性のスナップショットの時点でできます。
分離とそれぞれ独自の長所と短所を持つシーケンスの前に細胞から核を解放するための戦略は複数あります。ここで、説明と下流の並列 snRNA Seq の大人の脊髄からの核の隔離を有効にする 2 つのプロトコルを比較: 洗剤機械換散および低張性機械換散。洗剤機械換散では、完全な組織破壊と核の高い最終的な利回りを提供しています。低張性機械溶解には量と最終的に核収量の純度のバランスを選択する機会を提供する組織破壊度制御できるにはが含まれます。これらのアプローチは匹敵する RNA の収穫、核および細胞型プロファイルごとの遺伝子の検出数を提供しも両方使用できます正常に snRNA シーケンスの
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの究極の目標は、下流の転写解析のための高品質の RNA を含む核を分離することです。我々 は、すべての脊髄の細胞型をプロファイルするために snRNA Seq メソッドを適応しました。当初、ことが判明した典型的な細胞解離方法ない単一細胞 RNA シーケンス、効果的な脊髄神経が細胞死を特に受けやすい。さらに、細胞解離手法は 100 倍までいくつかによるさまざまな活動とスト?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NINDS イントラミュラル プログラムによって支えられた (1 ZIA NS003153 02) と NIDCD (1 ZIA DC000059 18)。C. ケーテ原稿を確認して、テクニカル サポートと有用な議論の c. i. Dobrott L. 李を感謝いたします。
Materials
| Sucrose | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (pH = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M1028-10X1ML | |
| 0.5 M EDTA (pH = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | Add DTT just prior to use |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Nuclease-free water | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (pH = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
| 1 M MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50X) | Gibco | 17504-044 | |
| 1X PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04% BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U/μL RNAse Inhibitor | Lucigen | 30281-1 | |
| Oak Ridge Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| Disposable Cotton-Plugged Borosilicate-Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Glass Tissue Dounce (2 ml) | Kimble | 885303-002 | |
| Glass large clearance pestle | Kimble | 885301-0002 | |
| Glass small clearance pestle | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | IKA | 3737001 | |
| Dispersing tool (S 10 N – 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers, 30 μm | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| Conical tubes | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y Fixed-Angle Rotor | Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| Sterological Pipettes: 5 ml, 10 ml | Denville Scientific | P7127 | |
| Hemocytometer | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube with Cell Strainer Cap (35 μm) | Corning | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| Chromium Single Cell 3’ Library and Gel Bead Kit v2, 4 rxns | 10X Genomics | 120267 | |
| Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns | 10X Genomics | ||
| Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) | Corning | 353002 |
References
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