Summary

植物昆虫細胞でのタンパク質を分泌生産するバキュロ ウイルス発現ベクターを変更します。

Published: August 20, 2018
doi:

Summary

ここでは、昆虫にセルとバキュロ ウイルス蛋白質結晶化の植物の分泌タンパク質の大量生産にタンパク質発現のシステムを利用するためのプロトコルを提案する.バキュロ ウイルス発現ベクターは、GP67 や植物タンパク質分泌発現昆虫細胞での昆虫ヘモリン シグナルペプチドと変更されています。

Abstract

真核生物遺伝子組換え分泌蛋白質構造および生化学的研究を表現する科学者のための挑戦だった。バキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系は、いくつかの翻訳後修飾遺伝子組換えの真核生物の分泌蛋白質を表現するために使用するシステムの一つです。分泌タンパク質は、タンパク質の糖鎖修飾、ジスルフィド結合の形成および他のポスト翻訳の修正の分泌経路を介してルーティングされる必要があります。既存昆虫細胞分泌植物タンパク質発現を高めるためには、バキュロ ウイルス発現ベクターは GP67 のいずれかの追加またはプロモーターと多重クローニング サイトの間ヘモリン信号のペプチッド シーケンスによって変更されます。この新設計変更されたベクトル システムは、シロイヌナズナの可溶性組換え分泌植物受容体タンパク質の高収率に成功しました。X 線結晶学的研究 2 発現植物タンパク質、シロイヌナズナ TDR と PRK3 の細胞膜受容体の細胞外ドメインの結晶化しました。変更されたベクトル システムは動物の王国と同様に組換え分泌蛋白質の表現の可能性のある使用できる改良されたツールです。

Introduction

特に x 線結晶構造解析のための生化学的および生物物理学的特性の均質な組換えタンパク質の大量生産ができるように研究所が不可欠です。大腸菌酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞、植物細胞などそれらの間など定評の異種発現系が多い、バキュロ ウイルス媒介昆虫細胞発現系は、ほとんどの一つです。構造的に折り畳まれた大型真核生物に向けた組換えタンパク質タンパク質結晶化1の大量に生産するのに技術が使用されます。

バキュロ ウイルス発現系の表現のベクトルは、強い由来ポリヘドリン遺伝子または遺伝子組換え細胞内タンパク質2,3の高収率を生成する P10 プロモーターを含む設計されています。組換えバキュロ ウイルスをするためには、興味の遺伝子が違いによるとマルチ nucleopolyhedroviral ゲノム由来ポリヘドリン遺伝子 (polh) の軌跡を含む昆虫ベクトルに複製されます。結果としての構築は、シーケンシャルなその正しいオープンリーディング フレーム (ORF) が確認されます。正しいコンストラクト トランスフェクションのプロセスを介して宿主昆虫細胞に導入します。興味の遺伝子は相同組換えによってウイルスのゲノムに挿入されます。このイベントは、組換えウイルスのゲノムは、組み換え体を生成するが、複製が芽生えてウイルス粒子1の生産の結果します。

昆虫細胞発現系において最も一般的に使用される、Sf9 と高の 5 (Hi5) セルです。Sf9 細胞 Sf21、ハスモンヨトウの frugiperdaの蛹卵巣細胞由来のクローンの分離、Hi5 細胞クローン分離親Trichoplusia ni卵巣細胞ライン TN 3684,5から派生しました。Sf9 細胞の共同 transfections、ウイルスの増幅、およびプラクの試金を実施する Hi5 細胞が通常より高い組換えタンパク質6量を生成する選択されています。変異ウイルスを生成する傾向があるため、Hi5 細胞を世代ウイルス後代の増幅に適してない注目に値するです。従来は、25-30 ° C の温度範囲は、昆虫細胞の培養に適していると見なされます。ただし、27 ~ 28 ° C が昆虫の細胞の成長および感染症7,8の最適な温度であることが報告されています。

分泌されるタンパク質の高発現遺伝子の前強い信号系列の導入が必要です。効率的に信号シーケンスは翻訳された組換えタンパク質を小胞体タンパク質の分泌と適切な折り畳みと安定化3に必要な翻訳後修飾に導きます。信号ペプチド配列、バキュロ ウイルスを包む蛋白質 GP64/67、ミツバチ メリチンなどなどバキュロ ウイルスによる発現システム3分泌遺伝子組換え蛋白質の発現を促進するのに選択されています。GP67 のシグナルペプチドの導入は、ターゲット遺伝子9の内因性信号のペプチッドを使用と比較して、分泌の組換え蛋白質の表現の収量を改善するために示されています。ヘモリン細菌感染10時に誘起される巨大な絹蛾Hyalophora 丹野、皓三の体液蛋白質であります。誘導式の比較的高レベルによるバキュロ ウイルス昆虫細胞における組換えタンパク質の分泌発現を仲介する遺伝子の信号のペプチッド シーケンスを使用できます。

シロイヌナズナ管状要素分化抑制因子受容体 (TDR) と両方蛋白質11,12 の植物ロイシン豊富な繰り返し受容体様キナーゼ (LRR RLK) の家族に属している花粉受容体キナーゼ 3 (PRK3).構造と植物受容体タンパク質も他の植物の分泌タンパク質の構造および生化学的解析が容易になるのこのファミリーの機能を研究するためにバキュロ ウイルス昆虫細胞発現系に変更されています蛋白質の品質と生産の収量を向上させます。TDR と PRK3 の両方の細胞外ドメインは、バキュロ ウイルス昆虫細胞発現系の 2 つの変更された表現のベクトルを使用して正常に表現されています。TDR と PRK3 蛋白質の両方の細胞外ドメイン、結晶化されています。この記事は、GP67 またはプロモーターと複数クローン間ヘモリン信号シーケンスのいずれかを組み込むことによって式と 2 つの変更されたバキュロ ウイルス発現ベクターで遺伝子組換え分泌植物タンパク質の大量精製を報告します。サイト。

Protocol

注: 分泌植物蛋白発現および結晶化のための変更された表現のベクトルとバキュロ昆虫細胞システムが使用されます。 1. 植物タンパク質分泌発現の GP67 シグナルペプチドとバキュロ ウイルス発現ベクターの変更 5′ BglII 切断サイト13GP67 の分泌シグナル配列とノッティ、病原、EcoRI、行った、サリ、SpeI、XbaI、PstI、XhoI (図 1 a) …

Representative Results

図 1に示すように、GP67 またはヘモリン信号シーケンスのいずれかの標的遺伝子の組み込み信号シーケンスに置き換えると分泌された蛋白質を表現する 2 つの変更された pFastBac1 バキュロ ウイルス発現ベクターが使用されました。ウイルス GP67 と昆虫ヘモリン遺伝子は、細胞の高い分泌発現レベルに実証されています。これらの 2 つの信号シーケ…

Discussion

サイズおよび生物学的システムで現在の蛋白質の何千もの安定性の多様性を考えると、それは実証研究のためはしばしば特定の蛋白質の表現のために選択される異種発現システムを決定する室します。大腸菌発現系は多くの場合19をスケール アップする細菌は、低コストの文化、メディアおよび相対的な容易さの短いライフ サイクルのための蛋白質の表現のための最…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、Guozhou の徐のノースカロライナ州立大学から新しい学部スタートアップ資金によって支えられました。

Materials

Incubator shaker VWR Model Excella E25 27 oC
Incubator VWR Model 2005 27 oC
Centrifuge BECKMAN Model J-6 with a swing bucket rotor
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent 600677-51 For PCR amplification of DNA
Thermal Cycler BIO-RAD Model C1000 Touch For PCR amplification of DNA
Incubator shaker New Brunswick Scientific Model I 24 For growing baceria culture
Customer DNA synthesis GENSCRIPT
BamHI (HF) New England Biolabs R3136S Restriction Endonuclease
BglII New England Biolabs R0144S Restriction Endonuclease
NotI (HF) New England Biolabs R3189S Restriction Endonuclease
XhoI New England Biolabs R0146S Restriction Endonuclease
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202T DNA ligation
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 DNA purification from Agorase gel
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 Plasmid DNA purification from bacteria culture
Agarose Thermo Fisher Scientific 15510-019 For DNA gel electropherosis
MAX Efficiency DH5α competen cell Invitrogen 18-258-012 For transformation of DNA ligation mixture
Lennox L LB Broth Research Product International Corp. L24066-5000.0 For making bacteria culture
Ampicillin sodium salt Thermo Fisher Scientific 11593-019 Antibiotics
Kanamycin Sulfate Thermo Fisher Scientific 15160-054 Antibiotics
Tetracycline Thermo Fisher Scientific 64-75-5 Antibiotics
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15710-064 Antibiotics
MAX Efficiency DH10Bac competent cells Thermo Fisher Scientific 10361-012 For making bacmid DNA
S.O.C. Medium Thermo Fisher Scientific 15544-034 For DNA transformation
CellFECTIN II Reagent Thermo Fisher Scientific 10362-101 Insect cell transfection reagent
Bac-to-Bac Expression System Thermo Fisher Scientific 10359-016 Baculovirus-insect cells expression kit
Bluo-gal Thermo Fisher Scientific 15519-028 For isolation of recominant Bacmid DNA
IPTG Thermo Fisher Scientific 15529-019 For isolation of recominant Bacmid DNA
pFastBac1 Thermo Fisher Scientific 10360014 Baculorirus expression vector
Sf9 cells Thermo Fisher Scientific 11496015 Sf9 monolayer cells
Hi5 cells Thermo Fisher Scientific B85502 High Five insect cells
Grace’s insect medium, unsupplemented Thermo Fisher Scientific 11595030 Sf9 cell transfection minimum medium
Grace’s insect medium, supplemented Thermo Fisher Scientific 11605102 Sf9 monolayer cell culture complete medium
Sf-900 II SFM Thermo Fisher Scientific 10902104 Sf9 suspension cell culture medium without FBS
Express Five SFM Thermo Fisher Scientific 10486025 Hi5 cell culture medium
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122 100 ml (10,000 I.U./ml)
L-Glutamine (200 mM)  Thermo Fisher Scientific 25030081 100 ml
FBS Certified Thermo Fisher Scientific 16000-044 500 ml
6-well plates Thermo Fisher Scientific 08-772-1B Flat-bottom
150 mm plates Thermo Fisher Scientific 353025 100/case
1.5 ml Microcentrifuge Tubes USA Scientific 1415-2500 500 tubes/bag
15 ml conical screw cap centrifuge tubes USA Scientific 1475-0511 25 tubes/bag
50 ml conical screw cap centrifuge tubes USA Scientific 1500-1211 25 tubes/bag
Ni-NTA Superflow Qiagen 30430 NiNTA resin
pH-indicator strips EMD Millipore Corporation 1.09535.0001 pH 0 – 14

References

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Cite This Article
Chakraborty, S., Trihemasava, K., Xu, G. Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells. J. Vis. Exp. (138), e58283, doi:10.3791/58283 (2018).

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