効率的かつスケーラブルな臨床的に互換性のある角膜輪部上皮幹細胞ひと多能性幹細胞からの分化

眼表面で透明な角膜、網膜に入力する光と目の屈折力の大半を提供できます。最も外側の層は、重層の角膜上皮は、輪部上皮幹細胞 (LESCs) によって継続的に再生成されます。LESCs はして角膜ジャンクション^1,2輪部のニッチの基底層に存在します。LESCs は、同定推定マーカーの一連のより広範な分析が必要ですので、具体的かつユニークなマーカーを欠いています。上皮性転写因子 p63、特に N 末端切り捨てられた謄本 p63 のアルファのアイソ フォーム (ΔNp63α) は、関連する肯定的な LESC マーカー^3,4として提案されています。LESCs の非対称分裂自己更新しますが、また centripetally と前方移行子孫を生成することができます。セルに向かって前進する角膜の表面に徐々 に自分の幹細胞性を失うし、最終的に末期患者が継続的に角膜の表面から失われる表層の扁平上皮細胞に区別するため。

重度の視覚障害につながることができますいずれかの角膜の層への損傷と角膜欠損を世界的な視野の損失の導く原因の 1 つ。輪部幹細胞 (LSCD) の欠乏症で、角膜が病気や conjunctivalization や角膜の混濁、ビジョン^5,6のそれに続く損失につながる外傷によって破壊されました。自家および同種の輪部移植を用いた細胞補充療法は、LSCD^4,7,8,9症例に対する治療戦略を提供しています。健康な眼に合併症のリスクを負う自家移植を収穫し、ドナー組織が不足します。ひと多能性幹細胞 (hPSCs)、ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs)、具体的には、臨床的に関連する細胞の種類、角膜上皮細胞を含む無制限のソースとして使用できます。したがって、hPSC から派生した LESCs (hPSC-LESCs) は、眼セル置換療法のための魅力的な新しい細胞ソースを表します。

伝統的に、未分化 hPSC 培養法とその微分のプロトコル LESCs に未定義のフィーダー細胞、動物血清、エアコンのメディア、または羊膜^10、11,の使用に依存しています。^12,13,14,15. 最近、細胞療法製品を安全への取り組みより標準化された、無料の異種文化および分化プロトコルの検索を求めています。その結果、画一的な hPSCs の長期培養定義、xeno 無料方法はいくつかは、市販^16,17,18をされます。連続体、角膜上皮の運命に hPSCs を誘導する分子手掛かりに依存するプロトコルが最近されている分化紹介^{19,20,21,22、 23}。まだこれらのプロトコルの多くは材料、または分化のための複雑な異種の成長因子カクテルを開始としてどちらかの未定義、フィーダー ベースの hPSCs を使用しました。

このプロトコルの目的は、信頼性の高い、最適化された、xeno を提供するために-hPSC のフィーダー フリー培養法と角膜 LESCs へのそれに続く分化。ラミニン 521 (LN-521) 行列 (具体的には不可欠な 8 フレックス) 定義、アルブミン無料 hPSC 中に多能性 hPSCs の単層培養により分化の均質な出発物質の迅速な生産ができます。その後、単純な 2 段階差別化戦略は懸濁液、LESCs に、付着性の分化に続く表面の外胚葉運命に向かって hPSCs をガイドします。> 65% が ΔNp63α を表現する細胞集団は 24 日以内に取得されます。Xeno とフィーダー フリー プロトコルは、セルの行の特定の最適化の必要はなく、いくつかの hPSC ライン (hESCs と hiPSCs の両方) のテストされています。週末無料メンテナンス、継、cryostoring、hPSC LESC フェノタイピングここで説明のためのプロトコルのための高品質 LESCs の大規模なバッチの生産を有効に臨床や研究の目的。